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Commencez par une agar molle en fusion maintenue à une température chaude.
Inoculez une culture de Pseudomonas syringae , la souche testée, dans l’agar.
Puis un vortex brièvement pour répartir les cellules uniformément.
Versez le mélange sur une plaque d’agar solidifiée et étalez-le uniformément.
Fermez le couvercle et laissez solidifier.
Repérez un surnageant filtré à la surface de l’agar solidifié.
Le surnageant contient de la bactériocine, une molécule antibactérienne dérivée d’une souche de donneur induite par le stress, P. syringae .
Incubez la plaque pour permettre la croissance bactérienne et la diffusion de la bactériocine à travers l’agar.
La bactériocine se lie à des récepteurs de surface spécifiques de la souche testée et perturbe sa membrane, entraînant la mort cellulaire.
Cela entraîne la formation d’une zone claire sur l’agar, indiquant la zone où la souche testée a été éliminée par la molécule antibactériocine.
Diluez la culture de 1 à 100 dans un KB frais. Faites couver la culture pendant trois à quatre heures en secouant à température ambiante. Ensuite, préparez de l’agar à l’eau stérilisée en autoclavant une suspension d’agar dans de l’eau ultra-pure.
Maintenez l’agar mou fondu dans un bain-marie à 60 degrés Celsius avant utilisation. À l’aide d’une pipette sérologique stérile, transférez trois millilitres d’agar mou dans un tube de culture stérile. Remet le tube de culture dans le bain-marie pour le maintenir dans un état fondu.
Avant de verser la couche, laissez refroidir l’agar en fusion, mais ne la laissez pas solidifier.
Il est crucial que l’agar soit maintenu à un état chaud et complètement fondu avant l’inoculation. Sinon, la superposition aura un aspect granuleux et sera plus difficile à interpréter.
Dans un capot stérile, inoculez 100 microlitres de la culture de souche testeuse dans l’agar mou et le vortex pour mélanger. Faites tourner la culture à la main pendant 10 à 15 secondes, puis versez-la sur le fond d’une plaque d’agar. Inclinez la plaque dans toutes les directions pour que l’agar tendre couvre uniformément l’agar inférieur.
Couvrez l’assiette et laissez-la solidifier 20 à 30 minutes. Faites attention à ne pas déranger la plaque pendant la solidification. Une fois solidifié, placez deux à cinq microlitres de surnageant sur la couche.
Laissez les plaques incuber toute la nuit à température ambiante. Observez et notez les résultats le lendemain matin. Grâce à cette méthode, deux souches de P. syringae sont inhibées par différentes bactériocines. La souche A est sensible à une bactériocine de haut poids moléculaire, la tailocine, mais pas sensible à une bactériocine alternative de faible poids moléculaire.