Mesure quantitative de GLUT4 Translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux
7 novembre 2010
Ce protocole décrit une technique rapide pour quantifier la translocation de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique des cellules par cytométrie en flux.
L'objectif général de cette procédure est de détecter la translocation de GLUT4 vers la membrane plasmique des cellules de mammifères en réponse à une exposition à l'insuline. Des myoblastes privés de sérum, ne possédant que des protéines GLUT4 intravésiculaires, sont d'abord ensemencés dans une plaque de culture de 24 puits. Un anticorps dirigé contre un épitope externe de GLUT4, pré-incubé avec un anticorps secondaire marqué par un fluorochrome, est ensuite ajouté aux cellules, suivi de l'insuline.
L'engagement des récepteurs de l'insuline à la surface des cellules entraîne la translocation de GLUT4 vers la surface de la membrane plasmique. GLUT4 est ensuite reconnu par les anticorps présents dans le milieu. À ce stade, les cellules peuvent être fixées et l'intensité de la coloration fluorescente peut être mesurée par cytométrie en flux.
Cette méthode peut être utilisée pour étudier la translocation de GLUT4 et le métabolisme du glucose, mais peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme la dégranulation des cellules NK par exposition de CD107a à la membrane. Pour cette procédure, il est important d'utiliser des cellules en croissance active ou ayant une confluence de 60 à 80 %, et ayant été privées de sérum pendant la nuit. Après récolte des cellules par trypsine, lavez-les et resuspendez-les dans un milieu de croissance ordinaire à une concentration de 200 000 cellules par millilitre, puis plaquez les cellules dans une plaque de 24 puits à raison de 0,1 million par 500 microlitres par puits. Incubez ensuite les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius afin de permettre aux cellules de se remettre de la trypsine.
Entre-temps, mélangez l'anticorps primaire anti-gluté quatre et l'anticorps secondaire marqué à l’Alexa Fluor 4 8 8, de poulet anti-IgG, dans un rapport de cinq pour un. Calculez le volume final nécessaire, en tenant compte du fait que 10 microlitres du mélange d'anticorps seront utilisés pour chaque puits. Incubez le mélange d'anticorps pendant 10 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Pendant l'incubation du mélange d'anticorps, préparez une solution mère deux fois concentrée d'insuline en la diluant à la concentration souhaitée dans le milieu de croissance.
Une fois que les cellules ont été incubées pendant une heure, retirez-les de l'incubateur. Ajoutez délicatement 10 microlitres de solution d'anticorps dans chaque puits contenant des cellules. Veillez à laisser au moins un puits non coloré.
Cet échantillon négatif sera utilisé ultérieurement pour régler le cytomètre en flux. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de la solution mère d'insuline deux fois concentrée dans chaque puits afin d'induire la translocation de GLUT4 vers la surface cellulaire, puis incubez la plaque pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius à l'abri de la lumière. Après avoir retiré les cellules de l'incubateur, fixez-les en ajoutant un millilitre de PBS contenant 1 % de PFA dans chaque puits et incubez la plaque pendant 20 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. À l’aide d’un grattoir à cellules, détachez délicatement les cellules fixées du fond des puits et transférez-les, depuis chaque puits, vers un tube FACS individuel.
Centrifuger les tubes pour former un culot cellulaire, puis vortexer et resuspendre les cellules dans un millilitre de PBS afin de les laver, puis centrifuger à nouveau les cellules ; répéter le lavage. Répéter deux fois. Jeter le surnageant entre chaque lavage.
Enfin, resuspendre les cellules lavées dans 400 microlitres de PBS contenant 1 % de PFA. Les cellules peuvent désormais être analysées pour l'expression membranaire de Glut4 par cytométrie en flux. Une fois arrivé(e) à la cytomètre en flux avec vos échantillons, commencez l'acquisition des données à partir du témoin non coloré.
Définir une fenêtre large pour les cellules vivantes à l’aide des paramètres de diffusion directe et latérale. Ensuite, régler le voltage du canal FL1 de manière à ce que le pic négatif soit visible dans les marges de l’histogramme. Une fois ces paramètres définis, analyser chaque échantillon expérimental en enregistrant au moins 10 000 événements viables par tube.
Cet histogramme montre la surexpression de la coloration de la force de surface du glut chez les myoblastes exposés à 0, 1, 10 ou 100 nanomolaire d'insuline. En revanche, les myoblastes provenant d'individus résistants à l'insuline ne parviennent pas à surexprimer le glu quatre en réponse à 100 nanomolaire d'insuline. Si les intensités de fluorescence moyennes des cellules stimulées sont normalisées par rapport à celles des cellules non stimulées, il est possible de comparer directement les IMF des myoblastes sains et résistants à l'insuline.
Grâce à cette procédure, les cellules peuvent être marquées avec des marqueurs supplémentaires, membranaires ou intracellulaires, afin d'identifier différents sous-ensembles cellulaires au sein de populations mixtes.
Aperçu
Ce protocole décrit une technique rapide permettant de quantifier la translocation de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique des cellules par cytométrie en flux. La méthode permet la détection de la translocation de GLUT4 en réponse à l'exposition à l'insuline dans des cellules de mammifères.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Métabolisme
- Cytométrie en flux
Contexte
- GLUT4 est un transporteur de glucose qui transloque vers la membrane plasmique en réponse à l'insuline.
- La compréhension de la translocation de GLUT4 est essentielle pour l'étude du métabolisme du glucose.
- Cette méthode peut également être appliquée à d'autres processus cellulaires, tels que la dégranulation des cellules NK.
- La privation de sérum est nécessaire pour garantir une mesure précise de la translocation de GLUT4.
Objectif de l'étude
- Quantifier la translocation de GLUT4 vers la membrane plasmique.
- Analyser les effets de l'insuline sur la localisation de GLUT4 dans les myoblastes.
- Fournir un protocole pouvant être adapté à d'autres études cellulaires.
Méthodes utilisées
- Des myoblastes privés de sérum sont ensemencés dans une plaque de 24 puits.
- Des anticorps dirigés contre la GLUT4 sont utilisés pour marquer les cellules.
- De l'insuline est ajoutée pour déclencher la translocation de la GLUT4.
- La cytométrie en flux est utilisée pour mesurer l'intensité de la coloration fluorescente.
Résultats principaux
- L'exposition à l'insuline entraîne une translocation importante du GLUT4 vers la surface cellulaire.
- Les myoblastes résistants à l'insuline présentent une régulation à la hausse du GLUT4 altérée.
- L'intensité fluorescente peut être utilisée pour comparer les cellules saines et les cellules résistantes à l'insuline.
- La méthode permet une coloration supplémentaire de marqueurs de surface ou intracellulaires.
Conclusions
- Ce protocole quantifie efficacement la translocation de GLUT4 en réponse à l'insuline.
- Il peut être adapté à diverses études cellulaires allant au-delà du métabolisme du glucose.
- La compréhension des dynamiques de GLUT4 peut fournir des informations sur les troubles métaboliques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La quantification de la translocation de GLUT4 fournit une mesure fonctionnelle directe de l'efficacité de la signalisation de l'insuline dans les modèles de maladies métaboliques. Cet essai fondé sur la cytométrie en flux permet une évaluation rapide et quantitative de l'engagement de la cible et de l'activation de la voie dans les cellules sensibles à l'insuline. Il soutient la validation précoce des cibles et la réduction des incertitudes mécanistiques pour les thérapeutiques du diabète et de l'obésité en reliant l'intervention moléculaire aux mécanismes physiologiques de l'absorption du glucose.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Mesure la translocation fonctionnelle de GLUT4 afin de valider l'activation de la voie du récepteur de l'insuline dans les cellules de mammifères.
- Valeur opérationnelle : Permet le criblage à haut débit de composés ou de perturbations génétiques affectant l'exposition de GLUT4 induite par l'insuline.
- Valeur prédictive : L'intensité de fluorescence moyenne normalisée permet une comparaison directe entre phénotypes sains et résistants à l'insuline pour la priorisation des cibles.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : Le protocole est terminé en moins de 4 heures et accepte de 3 000 à 1 million de cellules par condition, permettant un criblage évolutif.
- Résultat quantitatif : La cytométrie en flux fournit des mesures précises de l’intensité fluorescente, corrélée aux niveaux de GLUT4 à la surface cellulaire.
- Reproductibilité : Inclut un témoin non marqué pour la standardisation de l’appareil et la cohérence du positionnement des portes entre les expériences.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise directement la résistance à l'insuline dans le diabète de type 2 en comparant la translocation de GLUT4 dans des myoblastes sains et résistants.
- Déminimisation du risque mécanistique : Confirme si les composés testés rétablissent la translocation induite par l'insuline dans les cellules résistantes.
- Continuité translationnelle : Facilite le passage de la découverte ciblée à la validation préclinique en reliant l'action moléculaire à la fonction de transport du glucose.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique, permettant l'évaluation de modulateurs de la voie de l'insuline, de la confirmation de la cible à la validation fonctionnelle dans des modèles de maladies métaboliques.
- Biologie de la découverte : Teste l'hypothèse selon laquelle un composé améliore la translocation de GLUT4 dépendante de l'insuline en tant que mécanisme d'action.
- Criblage : Fournit des lectures quantitatives compatibles avec la cytométrie en flux, adaptées au criblage de bibliothèques de composés dans des systèmes cellulaires adhérents.
- Analytique : Des rapports de MFI normalisés offrent une comparabilité statistique entre différentes conditions pour la sélection des hits et le profilage dose-réponse.
- Recherche translationnelle : Relie la modulation de la cible à la physiologie de l'absorption du glucose, soutenant les décisions d'avancement ou d'abandon dans les programmes sur les maladies métaboliques.
- Réutilisation en entreprise : Adaptable à d'autres événements de translocation (par exemple, la dégranulation des cellules NK via CD107a), augmentant ainsi l'utilité de la plateforme dans les domaines de l'immunométabolisme et de l'immuno-oncologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance mécanistique dans la modulation de la voie de l'insuline en quantifiant un effecteur clé en aval de la signalisation de l'insuline.
- Valeur opérationnelle : Un protocole normalisé, compatible avec la fixation, permet un traitement par lots et une reproductibilité interlaboratoires.
- Valeur stratégique : Réduit les faux positifs en exigeant des preuves fonctionnelles de translocation au-delà des tests de liaison ou de phosphorylation.
- Impact sur le portefeuille : Informe l'avancement ajusté au risque en confirmant l'engagement de la cible dans un test de transport du glucose physiologiquement pertinent.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire, cytométrie en flux et techniques d'immunofluorescence.
- Dépend d'un cytomètre en flux doté d'une détection de fluorescence (par exemple, canal FITC) et de contrôles de compensation appropriés.
- Exige des protocoles standardisés de privation sérique et de stimulation à l'insuline appliqués de manière uniforme entre les différents sites utilisateurs.
- L'adaptation à des cellules primaires ou à d'autres modèles peut nécessiter une optimisation de l'accès des anticorps et des conditions de fixation.
- Limité aux épitopes exposés à la surface ; ne permet pas la détection des pools intracellulaires ou de l'expression totale des protéines sans perméabilisation.
