Name: Mesure quantitative de GLUT4 Translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Apprenez à quantifier la translocation de GLUT4 vers la membrane plasmique par cytométrie en flux. Cette méthode rapide permet d'étudier le métabolisme du glucose et la réponse à l'insuline dans les myoblastes.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Mme Clifford Elder Graham White Doté Fonds de recherche et le NIH (AR059838) à CB, du NIH (AR052791, AR044387-ARRA, &amp; NS063298) pour LTT, et par le Baylor College of Medicine de cytométrie et de tri cellulaire de base avec un financement du NIH (NCRR S10RR024574, le NIAID AI036211, &amp; NCI P30CA125123). Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la NIH.

1. Coloration des cellules <ol><li> Préparer les cellules. Les cellules doivent être utilisées tout en pleine croissance (60 - 80% de confluence). Sérum affamer les cellules pendant la nuit, les cellules de la plaque à 0,1 million par puits dans 0,5 ml milieu sans sérum dans une plaque de 24 puits et les placer dans l'incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pendant 30 min - 2 heures pour récupérer à partir trypsinisation. </li><li> Mélanger les anticorps primaires et secondaires. Mélanger (5 pi de primaire anti-GLUT4 anticorps avec 1 poulet uL secondaire anti-chèvre anticorps IgG conjugué à AlexaFluor 488) x nombre de puits. Incuber 10 minutes à température ambiante, dans l'obscurité. </li><li> Préparer un stock de travail de l'insuline 2X en le diluant dans le milieu. </li><li> Vérifiez si les cellules ont adhéré ou non. </li><li> Ajouter délicatement 6 mélange d'anticorps uL et 0,5 mL de votre stock de travail 2X de l'insuline dans les puits contenant les cellules. Évitez toute turbulence du milieu. Incuber (37 ° C, 5% CO 2) pendant 30 minutes, dans l'obscurité. </li><li> Fixer les cellules en ajoutant 0,5 ml de PBS + 1% PFA dans chaque puits, sans secouer les cellules. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante, dans l'obscurité. </li><li> Si vos cellules ont adhéré aux puits, délicatement les soulever avec un lifter cellule. Transférer les cellules (1 mL au total) dans des tubes qui correspondent à votre cytomètre en flux et centrifuger pour sédimenter les cellules. </li><li> Laver le culot à deux reprises avec 1 ml de PBS et remettre en suspension dans 0,4 ml de PBS + 1% PFA. À ce stade, les cellules peuvent être enveloppés dans une feuille et de les conserver au réfrigérateur (4-8 ° C) ou prises pour le cytomètre en flux pour l'acquisition de données immédiates. </li></ol> 2. Acquisition de données <ol><li> Régler une porte large autour des cellules vivantes dans la diffusion latérale (SSC) par rapport à l'avant de dispersion (FCS) du panneau. Utiliser un tube négatif (cellules non traitées à l'insuline ou des cellules "taché" avec un contrôle isotypique) pour définir votre paramètre FL1. Assurez-vous de pointe est complètement dans le panneau, pas couper sur le côté inférieur. </li><li> Acquérir des données provenant d'au moins 10 000 cellules par tube. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Dessinez une porte autour des cellules vivent dans le panneau CSS vs FSC (figure 1A). Tracer les histogrammes de 488 AlexaFluor intensité de fluorescence en fonction du nombre de cellules dans la porte des cellules vivantes (figure 1B). Vous pouvez superposer des histogrammes différents de visualiser les différences, mais pour la quantification, de déterminer l'intensité moyenne et la médiane de fluorescence pour chaque population de cellules et d'utiliser ces numéros pour vos comparaisons (figure 1C). </li><li> Normaliser les données de la valeur obtenue en l'absence d'insuline, comme indiqué dans les figures 1C et 1D. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Dans les myoblastes isolés d'un individu sain (pas de résistance à l'insuline), l'insuline induit une translocation dose-dépendante de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique (Figure 1, gauche). En revanche, l'insuline ne pas provoquer la translocation de GLUT4 à la membrane plasmique des myoblastes isolés à partir d'un patient avec résistance à l'insuline (Figure 1, droite). <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Exemple d'une expérience de coloration. Myoblastes ont été isolés à partir d'un donneur sans résistance à l'insuline (à gauche) et chez un patient insulino-résistance (à droite). A, SSC (Side Scatter) versus FCS (forward scatter) parcelle avec une porte autour des cellules vivantes. B, les cellules fermées en Un, colorées avec l'anticorps contre un épitope externe de GLUT4, et de gauche non stimulées (rouge) ou stimulées par l'insuline 1 nm (bleu), 10 nm (orange), ou 100 nm (vert). Pour plus de clarté la figure, nous ne montrons données sans et avec 100 nM d'insuline pour les cellules insulino-résistance. C, les intensités moyennes de fluorescence (MFI) des histogrammes montré en B ont été normalisées à l'IMF des cellules non stimulées gauche (pas d'insuline). D, tracés des données normalisées de l'IMF histogrammes montré en B.

<ol><li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li>
<li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li>
<li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li>
</ol>

Nous avons démontré une technique rapide pour quantifier la translocation de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique des cellules par cytométrie en flux. GLUT4 est seulement transitoirement exprimé à la membrane plasmique des cellules et est endocytose. Depuis les anticorps liés restent attachés à la GLUT4, même pendant l&#39;endocytose, le signal de fluorescence donne le montant total de GLUT4 qui a été exposée à la membrane plasmique pendant la durée choisie d&#39;incubation en présence d&#39;insuline. Cette technique peut également être appliquée à l&#39;étude de la translocation d&#39;autres protéines à partir d&#39;un compartiment intracellulaire à la membrane plasmique, a fourni un bon anticorps dirigé contre un épitope externe de la protéine d&#39;intérêt est disponible. Par exemple, un test similaire est maintenant couramment utilisé pour évaluer le taux de la dégranulation des lymphocytes T cytotoxiques et lymphocytes natural killer en mesurant la translocation de CD107a à leur membrane plasmique 4,5. La translocation de la phosphatidylsérine du côté intérieur de la membrane plasmique à la face externe lors de l&#39;apoptose cellulaire ou une nécrose peut également être détectée par cytométrie en flux, en utilisant un fluorophore étiquetés annexine V 6. Outre la rapidité de l&#39;essai, la cytométrie en flux présente l&#39;avantage de permettre l&#39;étude de la translocation de la protéine à la membrane plasmique dans les populations de cellules mixtes. En effet, on peut combiner coloration pour les marqueurs de sous-ensemble de cellules et pour la protéine d&#39;intérêt, suivie par l&#39;acquisition de données sur un cytomètre en flux multi-laser 7. Les quantités d&#39;anticorps donnée au paragraphe 1.2 du protocole sont un point de départ; nous vous conseillons de titrer vos anticorps avec les cellules de votre intérêt pour déterminer la concentration d&#39;anticorps minimum qui vous donne un maximum de signal. Une bonne gamme de départ pour le premier anticorps anti-humain GLUT4, nous avons utilisé ici serait uL 10-10 par tube (anticorps-dire 0,2 à 2 mg par tube), chaque tube contenant pas plus de 1 million de cellules. Pour les autres anticorps primaires, se reporter aux instructions du fournisseur. La normalisation des données est nécessaire que l&#39;autofluorescence des cellules varie d&#39;un donneur à et d&#39;une expérience à.

<table><tbody><tr><td>Anticorps anti-GLUT4 humain</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>Dirigé contre un épitope externe de GLUT4</td></tr><tr><td>IgG de chèvre anti-poulet conjuguée à l’AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>Insuline humaine recombinante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifters</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>Coupés pour s’adapter aux puits</td></tr><tr><td>Tubes de 5 ml pour FACS</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>Adaptables à toutes les machines BD</td></tr></tbody></table>

mesure quantitative de glut4 translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Le glucose est la source principale d&#39;énergie pour le corps, nécessitant une régulation constante de sa concentration sanguine. Libération d&#39;insuline par le pancréas provoque l&#39;absorption du glucose par l&#39;insuline tissus sensibles, notamment le cerveau, les muscles squelettiques et les adipocytes. Les patients souffrant de diabète de type 2 et / ou l&#39;obésité se développent souvent une résistance de l&#39;insuline et sont incapables de contrôler leur homéostasie du glucose. Nouveaux éclairages sur les mécanismes de résistance à l&#39;insuline peuvent fournir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le diabète de type 2. La famille des transporteurs de glucose GLUT compose de treize membres répartis sur les différents tissus dans le corps 1. Type de transporteur du glucose 4 (GLUT4) est le transporteur de glucose majeurs qui médie l&#39;absorption par les tissus sensibles à l&#39;insuline, tels que le muscle squelettique. Lors de la liaison de l&#39;insuline à son récepteur, la translocation des vésicules contenant GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique, provoquant la captation du glucose. Réduction GLUT4 translocation est l&#39;une des causes de la résistance à l&#39;insuline dans le diabète de type 2 2,3. La translocation de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique peut être visualisée par immunocytochimie en utilisant un fluorophore conjugué GLUT4 anticorps spécifiques. Ici, nous décrivons une technique pour quantifier montant total de GLUT4 translocation vers la membrane plasmique des cellules pendant une durée choisie, en utilisant la cytométrie de flux. Ce protocole est rapide (moins de 4 heures, y compris d&#39;incubation avec de l&#39;insuline) et permet l&#39;analyse d&#39;aussi peu que 3000 cellules ou autant que 1 million de cellules par condition dans une expérience unique. Elle s&#39;appuie sur l&#39;anti-GLUT4 anticorps dirigé contre un épitope externes du transporteur qui se lient à elle dès qu&#39;elle est exposée dans le milieu extracellulaire après la translocation vers la membrane plasmique.

Ce protocole décrit une technique rapide pour quantifier la translocation de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique des cellules par cytométrie en flux.

Mesure quantitative de GLUT4 Translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux

Le glucose est la principale source d'énergie de l'organisme, nécessitant une régulation constante de sa concentration sanguine. La libération d'insuline par le pancréas induit ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter la translocation de GLUT4 vers la membrane plasmique des cellules de mammifères en réponse à une exposition à l'insuline. Des myoblastes privés de sérum, ne possédant que des protéines GLUT4 intravésiculaires, sont d'abord ensemencés dans une plaque de culture de 24 puits. Un anticorps dirigé contre un épitope externe de GLUT4, pré-incubé avec un anticorps secondaire marqué par un fluorochrome, est ensuite ajouté aux cellules, suivi de l'insuline.L'engagement des récepteurs de l'insuline à la surface des cellules entraîne la translocation de GLUT4 vers la surface de la membrane plasmique. GLUT4 est ensuite reconnu par les anticorps présents dans le milieu. À ce stade, les cellules peuvent être fixées et l'intensité de la coloration fluorescente peut être mesurée par cytométrie en flux.Cette méthode peut être utilisée pour étudier la translocation de GLUT4 et le métabolisme du glucose, mais peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme la dégranulation des cellules NK par exposition de CD107a à la membrane. Pour cette procédure, il est important d'utiliser des cellules en croissance active ou ayant une confluence de 60 à 80 %, et ayant été privées de sérum pendant la nuit. Après récolte des cellules par trypsine, lavez-les et resuspendez-les dans un milieu de croissance ordinaire à une concentration de 200 000 cellules par millilitre, puis plaquez les cellules dans une plaque de 24 puits à raison de 0,1 million par 500 microlitres par puits. Incubez ensuite les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius afin de permettre aux cellules de se remettre de la trypsine.Entre-temps, mélangez l'anticorps primaire anti-gluté quatre et l'anticorps secondaire marqué à l’Alexa Fluor 4 8 8, de poulet anti-IgG, dans un rapport de cinq pour un. Calculez le volume final nécessaire, en tenant compte du fait que 10 microlitres du mélange d'anticorps seront utilisés pour chaque puits. Incubez le mélange d'anticorps pendant 10 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Pendant l'incubation du mélange d'anticorps, préparez une solution mère deux fois concentrée d'insuline en la diluant à la concentration souhaitée dans le milieu de croissance.Une fois que les cellules ont été incubées pendant une heure, retirez-les de l'incubateur. Ajoutez délicatement 10 microlitres de solution d'anticorps dans chaque puits contenant des cellules. Veillez à laisser au moins un puits non coloré.Cet échantillon négatif sera utilisé ultérieurement pour régler le cytomètre en flux. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de la solution mère d'insuline deux fois concentrée dans chaque puits afin d'induire la translocation de GLUT4 vers la surface cellulaire, puis incubez la plaque pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius à l'abri de la lumière. Après avoir retiré les cellules de l'incubateur, fixez-les en ajoutant un millilitre de PBS contenant 1 % de PFA dans chaque puits et incubez la plaque pendant 20 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. À l’aide d’un grattoir à cellules, détachez délicatement les cellules fixées du fond des puits et transférez-les, depuis chaque puits, vers un tube FACS individuel.Centrifuger les tubes pour former un culot cellulaire, puis vortexer et resuspendre les cellules dans un millilitre de PBS afin de les laver, puis centrifuger à nouveau les cellules ; répéter le lavage. Répéter deux fois. Jeter le surnageant entre chaque lavage.Enfin, resuspendre les cellules lavées dans 400 microlitres de PBS contenant 1 % de PFA. Les cellules peuvent désormais être analysées pour l'expression membranaire de Glut4 par cytométrie en flux. Une fois arrivé(e) à la cytomètre en flux avec vos échantillons, commencez l'acquisition des données à partir du témoin non coloré.Définir une fenêtre large pour les cellules vivantes à l’aide des paramètres de diffusion directe et latérale. Ensuite, régler le voltage du canal FL1 de manière à ce que le pic négatif soit visible dans les marges de l’histogramme. Une fois ces paramètres définis, analyser chaque échantillon expérimental en enregistrant au moins 10 000 événements viables par tube.Cet histogramme montre la surexpression de la coloration de la force de surface du glut chez les myoblastes exposés à 0, 1, 10 ou 100 nanomolaire d'insuline. En revanche, les myoblastes provenant d'individus résistants à l'insuline ne parviennent pas à surexprimer le glu quatre en réponse à 100 nanomolaire d'insuline. Si les intensités de fluorescence moyennes des cellules stimulées sont normalisées par rapport à celles des cellules non stimulées, il est possible de comparer directement les IMF des myoblastes sains et résistants à l'insuline.Grâce à cette procédure, les cellules peuvent être marquées avec des marqueurs supplémentaires, membranaires ou intracellulaires, afin d'identifier différents sous-ensembles cellulaires au sein de populations mixtes.

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