Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 2:35 min • November 28th, 2025
Commencez par une plaque de culture contenant des bactéries intégrées sous un coussinet gélifié d’agarose pour immobiliser les bactéries et soutenir la croissance de la monocouche.
Les bactéries expriment constitutivement la protéine fluorescente verte, permettant une surveillance en temps réel de l’expression génique.
Verser un gel d’agarose supplémentaire autour du tampon pour sceller l’échantillon et le laisser solidifier à température ambiante.
Scellez la plaque avec du ruban adhésif, perforez-la pour permettre l’échange gazeux, puis inversez-la pour éviter la condensation.
Incubez la plaque à basse température pour stabiliser le gel et éviter la division bactérienne.
Ensuite, appliquez de l’huile d’immersion sur l’objectif et placez la plaque sur une scène de microscope confocale.
Lancer l’imagerie en accéléré.
À mesure que la GFP mûrit progressivement, elle commence à fluorescer. Lors de la division cellulaire, ces protéines fluorescentes sont réparties entre les cellules filles, provoquant une baisse de l’intensité de fluorescence.
Cela crée un motif de fluorescence en dents sciées, et les différences dans ce motif entre cellules génétiquement identiques dans le même environnement montrent un bruit biologique dans l’expression génique.
Pour imager les échantillons, retirez la fiole de l’eau et laissez la solution gelée refroidir à température corporelle. Verser trois millimètres de gel sur le périmètre de la plaque d’échantillon. Lorsque l’agarose est solidifiée, scellez la plaque avec du ruban adhésif et utilisez une aiguille de calibre 25 pour percer plusieurs trous dans le ruban.
Ensuite, placez la plaque à l’envers à quatre degrés Celsius pendant au moins 30 minutes pour permettre à l’agarose de se solidifier complètement, tout en évitant la mitose cellulaire. Dans les 24 heures, utilisez un microscope confocal à fluorescence pour localiser l’échantillon au plus faible grossissement possible et activer le système de mise au point automatique du microscope. Appliquez de l’huile sur l’objectif approprié et utilisez le contrôleur de plateforme pour déplacer la plaque afin d’étaler soigneusement l’huile.
Ensuite, activez à nouveau la mise au point automatique et suivez la suggestion par défaut pour les sections transversales en pas Z afin d’imager l’échantillon.