Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 2:23 min • November 28th, 2025
Commencez par Staphylococcus aureus suspendu dans une solution de trempe contenant des billes de silice, stockées à basse température pour préserver son état métabolique.
Homogénéisez les bactéries dans des conditions froides pour libérer le contenu intracellulaire tout en minimisant la dégradation enzymatique des métabolites.
Centrifugez le lysat et récoltez le surnageant riche en métabolites.
Ajoutez un solvant organique à l’extrait et au vortex pour précipiter les macromolécules à partir de métabolites solubles.
Centrifugeuse pour pelleter le précipité et transférer le surnageant dans des fioles.
Chargez les fioles dans un système de chromatographie liquide-spectrométrie de masse.
À l’intérieur de la colonne chromatographie, les métabolites interagissent avec la phase solide stationnaire en fonction de leurs propriétés chimiques.
Ajoutez un tampon pour éluer les métabolites. Ensuite, dirigez les métabolites vers la source d’ionisation par électropulvérisation du spectromètre de masse pour les ioniser.
Les ions sont ensuite séparés selon leur rapport masse/charge.
Les données résultantes sont comparées à une base de données de référence pour identifier les métabolites.
Pour commencer l’extraction des métabolites, il faut d’abord décongeler les échantillons sur de la glace humide. Ensuite, perturbez les cellules dans un homogénéiseur avec quatre accélérations de 30 secondes à 6000 tr/min, avec des périodes de refroidissement de deux minutes sur de la glace carbonique entre les cycles.
Clarifiez les lysats pendant 15 minutes dans un tube de microcentrifuge réfrigéré pré-refroidi à vitesse maximale. Après centrifugation, transférez le surnageant dans un tube propre de microcentrifuge. À l’aide d’une micropipette, transférez une petite portion de l’échantillon dans un tube microcentrifuge pour quantifier la teneur résiduelle en peptides comme décrit dans le protocole textuel.
Conservez le reste de l’échantillon à moins 80 degrés Celsius. Consultez le protocole texte pour l’analyse des métabolites via chromatographie liquide et spectrométrie de masse.