Nettoyage sélectif des vers de Caenorhabditis pour l’enrichissement du microbiote intestinal

Prenez une plaque de culture avec des larves de Caenorhabditis abritant les bactéries d’intérêt qui colonisent leur lumière intestinale.

L’assiette contient une souche bactérienne connue sous forme de nourriture. Affamez les vers pour qu’ils consomment toutes les bactéries et entrent dans un stade dormant.

Ajoutez un substrat et transférez les vers dans un tube.

Centrifugez et jetez le surnageant.

Ajoutez une solution de détergent, agitez pour éliminer les bactéries adhérentes à la surface, centrifugez à nouveau, puis jetez le surnageant.

Répétez le lavage, puis transférez les vers sur une plaque de culture fraîche.

Laissez le rampement éliminer les bactéries alimentaires faiblement liées de la surface et de la lumière intestinale tout en conservant les bactéries d’intérêt qui colonisent de manière stable l’intestin.

Répétez l’étape de transfert et de rampement pour garantir l’élimination complète des bactéries alimentaires.

Ajoutez le médium, transférez les vers dans une vitre de montre, puis disséquez pour exposer leurs intestins.

Disséquez les intestins contenant les bactéries d’intérêt, collectez-les dans des tubes remplis d’eau, puis congelez-les pour une utilisation future.

Pour affamer les vers et réduire le nombre de bactéries OP50-1, incubez les nématodes à 20 degrés Celsius pendant trois à quatre jours. Ajoutez 5 millilitres du média M9 à la plaque des vers récemment affamés, puis transférez le média et les vers M9 dans un tube centrifugeuse stérile de 15 millimètres pour centrifuger à 1 000 g pendant 30 secondes à température ambiante.

Retirez le surnageant avant de laver les vers cinq fois avec 10 millilitres de M9 contenant 0,05 % de Triton X-100 sur un Nutator pendant 20 minutes. Après le dernier lavage, retirez le surnageant sans déranger la pellete dans 100 microlitres de solution et transférez le M9 et les vers sur une plaque NGM de 6 centimètres non semée. Laissez sécher l’assiette pendant que les vers rampent pendant 20 minutes pour aider à retirer l’OP50-1 de la cuticule et de l’intestin.

Lorsque la plaque est sèche, répétez la procédure en ajoutant 250 microlitres de M9 et en transférant les vers sur une nouvelle plaque NGM de 6 centimètres non ensemencée afin de permettre aux vers de ramper pendant que la plaque sèche.

Après 20 minutes, ajoutez 250 microlitres de M9 à la plaque et transférez 100 microlitres de M9 avec des vers vers vers dans une vitre de montre propre.

Ensuite, décapitez les nématodes à l’aide d’une aiguille de seringue calibre 26 tout en maintenant le ver au sol avec une autre aiguille de seringue calibre 26.

Une fois décapité, l’intestin, une masse granuleuse et la gonade transparente s’éloignent naturellement du corps du nématode, puis coupent un morceau de l’intestin exposé et transfèrent un intestin disséqué dans un tube PCR de 0,5 millilitre contenant 10 microlitres d’eau stérile. Répétez la procédure pour prélever des intestins d’au moins cinq animaux différents dans des tubes PCR.

Congelez les tubes PCR à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 5 minutes. Décongelez les échantillons intestinaux avant de procéder à la PCR et au séquençage pour identification.