JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 3:04 min • January 30th, 2026
Commencez par une culture de Legionella pneumophila, une bactérie Gram négative pathogène qui libère des vésicules membranaires externes.
Ces OMV contiennent des lipopolysaccharides et des protéines membranaires qui contribuent à la virulence bactérienne.
Centrifugez la culture pour pelleter les bactéries intactes.
Collectez les OMV contenant le surnageant et centrifugez à nouveau pour pelleter les bactéries résiduelles.
Filtrez le surnageant à travers une membrane pour éliminer les bactéries restantes tout en conservant les OMV.
Effectuez une seconde filtration à l’aide d’une membrane fraîche pour éliminer les débris bactériens.
Collectez le filtrat sans bactéries et ultracentrifugez-le pour pelleter les OMV.
Jetez le surnageant, remettez le pellet en tampon, puis faites de l’ultracentrifugeuse pour éliminer les protéines faiblement associées et les lipopolysaccharides.
Retirez le surnageant et suspendez à nouveau les OMV purifiés en tampon.
Strier une aliquote des OMV sur les plaques d’agar sanguin et BCYE et incuber.
L’absence de formation de colonies confirme l’absence de contamination bactérienne.
Conservez les OMV à basse température pour les études d’interaction hôte-pathogène.
Ajoutez la culture liquide restante à 90 millilitres de milieu YEB frais et faites couver la culture sur un shaker rotatif jusqu’à atteindre un OD600 de 3,0 à 3,5. Centrifugez la culture liquide à 4 000 g pendant 20 minutes pour pelleter les bactéries. Ensuite, transférez le surnageant dans de nouveaux tubes centrifugeuses.
Jetez les granulés bactériens et centrifugez à nouveau les échantillons avant de répéter l’étape de centrifugation. Ensuite, stérilisez deux fois le surnageant restant par filtre.
Ensuite, transférez le surnageant sans bactéries dans des tubes ultracentrifuges et faites tourner les échantillons à 100 000 g à 4 degrés Celsius pendant 3 heures. Décantez le surnageant et jetez-le. Ensuite, utilisez du PBS stérile pour resuspendre les granulés OMV et les regrouper.
Répétez l’étape d’ultracentrifugation pour éliminer les protéines contaminantes et libérer le LPS. Maintenant, jetez le surnageant et séchez le tube ultracentrifuge avec un coton-tige stérile. Resuspendez le granule OMV avec 500 microlitres de PBS stérile.
Ensuite, tracez 20 microlitres chacun sur les plaques d’agar sanguin et d’agar BCYE pour éviter toute contamination bactérienne de la vésicule préparée. Incubez la plaque d’agar sanguine toute la nuit et la plaque d’agar BCYE pendant 3 jours.