Isolement des cellules épithéliales de la vessie de souris contenant des communautés bactériennes intracellulaires
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 2:56 min • February 2nd, 2026
Commençons par des cellules épithéliales de la vessie extraites d’une vessie de souris infectée par E. coli uropathique marqué par fluorescente.
Lors de l’infection, ces bactéries envahissent les cellules épithéliales et forment des communautés bactériennes intracellulaires, ou IBC — des structures biofilmées qui les protègent des défenses immunitaires de l’hôte.
Au microscope disséqueur, identifiez les IBC comme de grands agrégats fluorescents confinés dans des cellules épithéliales individuelles.
Assemblez un système de micropipetage buccal à l’aide d’un capillaire en verre tiré relié à une pipette aspirante pour isoler des cellules épithéliales individuelles contenant un IBC.
Trempez brièvement la pointe capillaire dans le PBS pour réduire l’absorption de liquide par les capillaires.
Positionnez le capillaire près de la cellule épithéliale fluorescente sélectionnée et appliquez une douce succion pour attirer une seule cellule contenant un IBC, évitant ainsi les cellules non infectées et les bactéries extracellulaires.
Expulsez la cellule dans un tube microcentrifuge stérile en utilisant une légère pression positive, préservant la viabilité bactérienne.
Cette méthode permet d’isoler les cellules épithéliales hébergeant des IBC pour une analyse unicellulaire.
Lorsque toutes les cellules ont été raclées, insérez l’extrémité non tirée d’un capillaire en verre tiré dans le bouchon en caoutchouc d’un tube aspirateur et ajustez fermement l’extrémité étroite d’une pointe de pipette de 1 millilitre dans l’autre extrémité ouverte du tube.
Ajustez fermement l’extrémité étroite d’une pipette aspirante de 2 millilitres dans l’extrémité ouverte et plus large de la pointe de la pipette de 1 millilitre et placez la suspension à cellules raclées sous un microscope disséqueur. En utilisant un grossissement de 20 à 40X, identifiez les IBC comme de gros agrégats fluorescents et plongez l’extrémité fine du capillaire en verre dans un tube neuf de PBS pendant 1 seconde afin de réduire l’absorption de volume indésirable par l’action capillaire.
Lorsqu’un IBC d’intérêt a été localisé, approchez lentement l’extrémité ouverte du tube capillaire vers le IBC et appliquez une très faible force d’aspiration à la pipette aspirante pour guider le CIB dans le capillaire vitreux. Ensuite, déplacez le capillaire vers un tube centrifuge vide de 1,5 millilitre et appliquez une légère pression positive pour expulser la gouttelette et l’IBC dans le tube.
Aperçu
Cet article décrit une méthode d'isolement de communautés bactériennes intracellulaires (IBCs) à partir de cellules épithéliales de la vessie infectées par des souches uropathogènes d'Escherichia coli. Cette technique permet l'analyse de cellules individuelles contenant des IBC, offrant ainsi des informations sur le comportement bactérien au sein des cellules hôtes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Biologie cellulaire
- Maladies infectieuses
Contexte
- Les souches uropathogènes d’E. coli peuvent envahir les cellules épithéliales de la vessie.
- Les CBI sont des structures semblables à des biofilms qui protègent les bactéries contre les réponses immunitaires.
- La compréhension des CBI peut contribuer au développement de traitements contre les infections urinaires.
- L’analyse à l’échelle de la cellule unique est essentielle pour étudier les interactions bactériennes au sein des cellules hôtes.
Objectif de l'étude
- Isoler les cellules épithéliales contenant des IBC pour une analyse détaillée.
- Comprendre la dynamique des communautés bactériennes au sein des cellules hôtes.
- Approfondir les connaissances sur les mécanismes de survie bactérienne dans les voies urinaires.
Méthodes utilisées
- Prélèvement de cellules épithéliales vésicales chez des souris infectées.
- Utilisation d'un microscope stéréoscopique pour identifier les IBC fluorescentes.
- Utilisation d'un dispositif de micropipette pour isoler des cellules uniques contenant des IBC.
- Préservation de la viabilité bactérienne pendant le processus d'isolement.
Résultats principaux
- Isolation réussie de cellules épithéliales contenant des IBC.
- Identification des IBC comme des agrégats fluorescents de grande taille.
- Démonstration de l'efficacité de la méthode pour l'analyse de cellules uniques.
- Apercus sur les mécanismes de protection des IBC contre les défenses de l'hôte.
Conclusions
- La méthode fournit une approche fiable pour étudier les IBC dans les cellules épithéliales de la vessie.
- Les cellules isolées peuvent être utilisées pour des recherches supplémentaires sur la pathogénie bactérienne.
- Cette recherche contribue à la compréhension des infections des voies urinaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'isolement de communautés bactériennes intracellulaires (IBCs) à partir de cellules épithéliales hôtes permet une détection mécanistique des cibles antimicrobiennes dans les modèles d'infection des voies urinaires. Cette approche soutient la validation des cibles en révélant les mécanismes de survie bactérienne au sein d'environnements cellulaires hôtes physiologiquement pertinents. La méthode offre une confiance prédictive pour l'identification de candidats thérapeutiques en reliant la persistance intracellulaire à l'efficacité thérapeutique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en isolant des cellules épithéliales viables contenant des BIC pour une évaluation fonctionnelle des cibles.
- Valeur opérationnelle : Permet la détection biologique des risques grâce à l'observation directe de populations bactériennes protégées par des antibiotiques.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en reliant les mécanismes de persistance intracellulaire aux résultats du traitement.
Développement de criblages et de tests
- Préparation du test : Prépare des systèmes hôte-pathogène validés pour le criblage de composés en aval ciblant les réservoirs intracellulaires.
- Résultat quantitatif : Génère des isolats monocellulaires permettant des détections basées sur la fluorescence ou le séquençage, pour une analyse riche en contenu.
- Reproductibilité : Standardise l'isolement par micropipette buccale afin d'assurer une récupération constante des cellules contenant des IBC au cours des expériences.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Utilise un modèle murin d'ITU afin de préserver la continuité translationnelle, de la découverte à la validation préclinique.
- Déminimisation du risque mécanistique : Cible spécifiquement les voies de survie intracellulaires afin de réduire l'ambiguïté dans le choix des cibles.
- Progression ajustée au risque : Guide les décisions d'avancement ou d'abandon en validant les cibles au sein de niches bactériennes protégées.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase initiale de découverte, permettant de tester des hypothèses avant l'identification de composés leaders et soutenant la continuité préclinique grâce à une compréhension mécanistique.
- Biologie de la découverte : Facilite l'élucidation des voies en isolant les cellules contenant des CBI de type biofilm pour l'interrogation ciblée.
- Écrans : Fournit des cellules uniques prêtes à être utilisées dans des tests afin d'évaluer la pénétration de composés dans les compartiments intracellulaires.
- Analytique : Fournit des isolats viables pour la quantification par fluorescence ou par séquençage ARN afin de comparer les effets des traitements.
- Recherche translationnelle : Relie les mécanismes de persistance intracellulaire à des modèles d'efficacité préclinique dans les infections urinaires.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme d'isolement réutilisable pour l'étude des pathogènes intracellulaires dans divers modèles d'infection.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en associant la localisation intracellulaire à la résistance phénotypique.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité grâce à des paramètres définis de micropipettage.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en réduisant les risques liés aux cibles dès les premières étapes du processus de découverte.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des antibiotiques dotés d'une activité intracellulaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie et en techniques de micropipette pour l'isolement de cellules uniques.
- Dépend de l'étiquetage fluorescent et d'une infrastructure de microscope stéréo pour la détection des cellules infectées par des bactéries intracellulaires (IBC).
- Exige une standardisation entre les opérateurs afin de maintenir la cohérence en termes de récupération cellulaire et de viabilité.
- Implique des ajustements à prendre en compte lors de l'application de la méthode à différents types de cellules épithéliales ou à divers modèles de pathogènes.
- Limité par le débit manuel, ce qui peut restreindre l'extensibilité pour des campagnes de criblage à grande échelle.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026