Détection de l’expression du gène cible dans un cerveau de souris infecté par des bactéries

Prenons l’ARN total extrait d’un cerveau de souris infecté par des bactéries pathogènes. L’extrait contient des transcrits provenant de gènes réactifs à l’infection.

Ajoutez une enzyme dégradant l’ADN et incubez pour dégrader l’ADN génomique résiduel.

Ajoutez un mélange maître contenant l’enzyme transcriptase inverse (RT), des nucléotides et des amorces non spécifiques.

Incuber pour synthétiser de l’ADN complémentaire (ADNc).

Introduisez une température élevée pour inactiver l’enzyme RT.

Prenez un mélange maître contenant de l’ADN polymérase, des nucléotides, un colorant double brin liant l’ADN et des amorces spécifiques à un gène cible.

Ajoutez l’ADN c et appliquez de la chaleur pour dénaturer l’ADN.

L’amorce se lie à l’ADN cible, permettant la synthèse d’un nouveau brin d’ADN.

Le cycle est répété pour amplifier le gène cible.

Le colorant se lie à l’ADN amplifié et émet de la fluorescence, qui est enregistrée à la fin de chaque cycle.

L’augmentation de la fluorescence confirme l’expression du gène réactif à l’infection dans le cerveau de la souris infectée.

Infecter toutes les souris utilisant des cellules planctoniques ou des cellules à l’état de biofilm et effectuer l’euthanasie comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, extraire l’ARN total du tissu cérébral à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN.

Pour chaque souris, utilisez tout le tissu cérébral pour extraire l’ARN. Divisez le tissu cérébral entier en cinq tubes. Prenez jusqu’à 100 milligrammes de tissu cérébral et ajoutez 1 millilitre de solution de lyse à chaque tube contenant la matrice de lyse fournie par le kit.

Extraire l’ARN en suivant les étapes indiquées dans le protocole texte. Ensuite, effectuer une synthèse d’ADNc, y compris l’élimination de l’ADN génomique, à l’aide d’un thermocycleur avec un kit de réactifs à transcription inverse. Ajoutez 1 microgramme d’ARN dans un tube contenant 2 microlitres de tampon d’élimination de l’ADN génomique 5x et 1 microlitre d’enzyme d’élimination de l’ADN génomique.

Ajoutez de l’eau sans RNase jusqu’à ce que le volume atteigne 10 microlitres. Écouver pendant 2 minutes à 42 degrés Celsius. Ajoutez 10 microlitres de mélange maître à la solution de réaction, puis mélangez doucement.

Procédez immédiatement à la réaction de transcription inverse en plaçant le tube à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, transférez la réaction à 85 degrés Celsius pendant 5 secondes. Effectuez l’analyse quantitative en temps réel en temps réel à l’aide d’une machine PCR en temps réel équipée d’un kit de PCR cyber quantitatif en temps réel. Suivant les instructions du kit, combinez l’enzyme, les amorces, le colorant de référence ROX 50x deux, et le gabarit d’ADNc. Ensuite, ajoutez de l’eau sans RNase jusqu’à atteindre un volume total de 20 microlitres.

Effectuez chaque échantillon en triple exemplaire en utilisant les paramètres thermiques listés dans le protocole texte et calculez la variation relative du pliage en fonction de la méthode CT du delta à deux moins delta.