Essai de co-infiltration pour le dépistage des effecteurs pathogènes qui suppriment le silence de l’ARN végétal

Prenez un mélange contenant des volumes égaux de deux suspensions d’Agrobacterium tumefaciens , chacune portant un plasmide — l’une codant pour la GFP, l’autre codant pour une protéine effectrice.

Percer un trou et utiliser une seringue sans aiguille pour infiltrer le mélange dans la surface inférieure des feuilles saines et entièrement développées de Nicotiana benthamiana 16c.

Tapez tout excès de suspension avec des tissus mous pour éviter la prolifération bactérienne.

Marquez les zones infiltrées et incubez les plantes dans des conditions de croissance optimales.

Agrobacterium transfère les ADN plasmidiques dans les cellules végétales, où les gènes GFP et effecteurs sont transcrits en ARNm et traduits en protéines.

Le système de défense de la centrale utilise le silencieux ARN, où les siRNA duplex sont chargés dans RISC. Le brin passager est retiré, et le brin guide dirige le complexe pour dégrader l’ARNm GFP cible.

Cependant, les protéines effectrices se lient aux siARN, empêchant leur association avec le RISC et permettant à la fluorescence de la GFP de persister.

Cela permet d’identifier des effecteurs pathogènes qui suppriment le silence de l’ARN végétal.

Mélangez des volumes égaux d’une culture Agrobacterium contenant une protéine fluorescente verte 35S avec une culture Agrobacterium contenant le suppresseur du virus mosaïque de concombre 35S 2b, un effecteur putatif ou un vecteur vide. À l’aide d’une seringue sans aiguille de 1 millilitre, infiltrez prudemment et lentement les suspensions mixtes d’Agrobacterium sur les côtés abaxiaux des feuilles de Nicotiana bethamiana 16c.

Retirez la suspension bactérienne restante des feuilles avec des lingettes pour tissus mous, puis entourez les bords des plaques infiltrées avec un stylo marqueur.