Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
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Commencez par des embryons transgéniques de poisson-zèbre exprimant des macrophages marqués fluorescentement, montés dans de l’agarose à faible fonte dans une boîte d’imagerie.
Ces embryons sont infectés par Mycobacterium marinum marqué par fluorescence par microinjection intramusculaire dans le mésencéphale, déclenchant une réponse immunitaire localisée.
Couvrir l’agarose solidifiée de milieux embryonnaires contenant des anesthésiques pour maintenir l’anesthésie et des inhibiteurs chimiques pour supprimer la pigmentation, assurant ainsi une clarté optique pour l’imagerie.
Placez la plaque dans la chambre environnementale d’un microscope confocal haute résolution.
À l’aide d’un éclairage en champ clair, localisez la région infectée.
Activez les canaux laser à fluorescence, réglez les positions de début et de fin de la pile Z, et initiez l’imagerie en accéléré.
Visualisez le macrophage infecté, rempli de bactéries fluorescentes, alors qu’il devient arrondi et immobile.
Cela indique la dégradation du cytosquelette et le début de la mort des cellules lytiques.
Avec le temps, le macrophage gonfle et se rompt, libérant le contenu cytoplasmique et les bactéries internalisées dans les tissus environnants, un signe de la mort inflammatoire des cellules lytiques.
Une fois l’agarose complètement solidifiée, recouvrez-la d’une couche d’eau d’œuf. Après avoir installé la chambre environnementale, placez le plat à fond en verre de 35 millimètres avec le poisson-zèbre dans la chambre environnementale. Ouvrez la diode 405, l’argon à 20 % de puissance, et le laser DPSS à 561 nanomètres. Configurez la puissance laser appropriée dans les réglages spectrum.
Choisissez le mode d’acquisition « XYZ » « Sequential Scan », et réglez le format des images sur « 512 par 512 pixels ». Passez en « mode données en direct », ciblez la position du premier poisson-zèbre, et marquez la position « Début » et « Fin » Z. Répétez ce processus pour chacun des embryons restants. Ajoutez une « Pause » à la fin du programme. Définissez la boucle et le cycle du programme, puis enregistrez le fichier.