Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 4:46 min • January 30th, 2026
Prendre une section gingivale de souris infectée par des bactéries pathogènes, prétraitée pour accéder à l’ADN bactérien.
Appliquez un tampon avec une sonde d’ADN marquée à la digoxigénine ciblant l’ADN bactérien.
Placez une housse et scellez pour éviter la déshydratation de l’échantillon.
Introduire de la chaleur pour dénaturer l’ADN, puis incuber dans des conditions chaudes et humides pour permettre l’hybridation par sonde.
Refroidissez la culasse et retirez la gaine de protection, puis lavez plusieurs fois avec un tampon pour retirer les sondes non reliées.
Ajoutez une solution bloqueante pour éviter la liaison non spécifique des anticorps.
Incubez avec des anticorps conjugués à l’enzyme qui se lient à la digoxigénine.
Laver pour éliminer les anticorps non liés.
Ajoutez un inhibiteur pour inactiver sélectivement l’enzyme endogène.
Appliquez un substrat qui réagit avec l’enzyme pour obtenir un précipité coloré.
Rincez à l’eau pour enlever l’excès de substrat.
Ajoutez un colorant pour colorer les noyaux.
Lavez pour enlever l’excès de colorant.
Déshydratez dans l’éthanol et traitez avec du xylène pour augmenter la transparence des tissus.
Montez la section.
Au microscope, visualisez les bactéries à l’intérieur de la section.
Commencez l’opération in situ en immergeant d’abord les lames dans 2x SSC pendant 20 minutes. En attendant, diluez la sonde marquée à 1 nanogramme par microlitre dans un tampon d’hybridation. Pour un témoin négatif, utilisez une concentration 10 fois supérieure à celle de la sonde non marquée. Ensuite, dénaturez les sondes en les chauffant à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis en les refroidissant rapidement sur de la glace.
Ensuite, appliquez le même volume de dilution de la sonde sur chaque lame que la protéinase K. Ensuite, couvrez soigneusement les sections avec du vernis à ongles. Maintenant, chauffez les lames sur un bloc de machine PCR à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes et transférez-les dans un incubateur humidifié à 45 degrés Celsius toute la nuit.
Le lendemain, refroidissez les lames à 4 degrés Celsius pendant une demi-heure, puis retirez soigneusement les gloutis de couverture. Les tissus sont fragiles. Enfin, faites passer les lames à travers une série de tampons SSC à température ambiante.
Lavez les lames hybrides in situ pendant 5 minutes dans MABT. Ensuite, appliquez 50 à 400 microlitres de solution bloqueante à 1 % Tween 20 pendant 20 minutes. Après l’incubation en bloc, appliquez 50 à 400 microlitres de 1 à 1000 anticorps anti-DIG phosphatase alcaline en solution bloqueante.
Laissez se fixer pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’application du primaire, lavez les lames en MABT pendant 10 minutes. Ensuite, pendant 5 minutes, mettez les lames dans un tampon de détection avec 1 % Tween 20.
Appliquez maintenant 50 à 400 microlitres de 1 millimolaire levamisole dans une solution tampon de détection sur chaque lame, puis incubez-les pendant 5 minutes pour inactiver la phosphatase alcaline endogène. Ensuite, ajoutez 50 à 400 microlitres de NBT/BCIP dilués dans un tampon de détection à 1 à 100 par lame, et laissez les lames incuber pendant 2 à 3 heures dans une chambre humidifiée, selon votre expérience.
Rincez les lames avec de l’eau DI. Ensuite, appliquez du vert de méthyl à 0,05 % du poids en volume et laissez la contre-coloration agir sur le tissu pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lavez à nouveau les lames avec de l’eau DI, puis déshydratez-les avec de l’éthanol à 100 %, puis plongeez dans le xylène. Enfin, appliquez 80 microlitres de support de montage et couvrez les lames.