Isolement et culture de bactéries à partir d’embryons de poisson-zèbre pour évaluer la charge infective

Prenons un embryon de poisson-zèbre infecté par Mycobacterium abcessus, une bactérie pathogène qui cible le système nerveux central et forme des abcès contenant des bactéries et des cellules immunitaires de l’hôte.

Incubez l’embryon sur de la glace pour l’immobiliser, puis exposez-le à une surdose d’anesthésique pour stopper l’activité cardiaque et neuronale, ce qui entraîne la mort.

Lavez l’embryon pour retirer l’anesthésique résiduel.

Ajoutez une solution détergente pour perturber les membranes cellulaires et lyser l’embryon.

Cisaillez le lysat à l’aide d’une aiguille pour homogénéiser le tissu et libérer les bactéries.

Centrifugez, jetez le surnageant et remettez le pellet en suspension dans une solution de tensioactif pour éviter l’agglomération bactérienne.

Diluez en série la suspension bactérienne et étalez-la sur des plaques d’agar.

Le milieu est complété par des antibiotiques pour inhiber la croissance d’autres microbes tandis que les cellules de Mycobacterium conçues pour la résistance aux antibiotiques prolifèrent.

Incuber pour favoriser la formation de colonies, permettant de quantifier la charge bactérienne de l’embryon.

Pour énumérer les unités formant des colonies ou les UFC au moment souhaité, prélever cinq embryons par condition infective et transférer chaque embryon dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Cryoanesthésiez les embryons par incubation sur glace pendant 10 minutes. Après avoir euthanasié les embryons avec 300 à 500 milligrammes par litre de tricaïne, utilisez de l’eau stérile pour les laver deux fois dans un nouveau tube.

Ensuite, après avoir retiré l’eau à 2 % de Triton X-100 dans 1 X PBS à chaque embryon, utilisez une aiguille de calibre 26 pour homogénéiser le tissu et la lyse complète.

Après centrifugation de la suspension, utilisez 1 PBST pour resuspendre le granule. Ensuite, la dilution en série des plaques des homogénéats sur le Middlebrook 7H10O ADC est complétée par le BBL MGIT PANTA.

Incubez les plaques à 30 degrés Celsius pendant 4 jours avant de compter les colonies.