JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 2:46 min • February 26th, 2026
Commençons par le surnageant produit par le microbiote intestinal humain lors de la fermentation in vitro des exopolysaccharides. Le surnageant contient des acides gras à chaîne courte déprotonée (SCFA) et d’autres métabolites.
Ajoutez de l’acide métaphosphorique pour abaisser le pH du surnageant et un vortex pour bien mélanger. Cela convertit les SCFA en leurs formes protonées, adaptées à l’analyse chromatgraphique en phase gazeuse.
Centrifugez pour séparer les débris et collecter le surnageant contenant les SCFAs et autres métabolites.
Filtrez le surnageant pour éliminer les débris résiduels et éviter les interférences avec la chromatographie.
Dans un système de chromatographie en phase gazeuse haute performance, injectez le surnageant dans l’entrée chauffée pour le vaporiser. Ensuite, mélangez la vapeur avec un gaz inerte et faites-la passer à travers une colonne de phase stationnaire polaire pour la séparation.
Les SCFA interagissent avec la phase stationnaire de la colonne et se séparent en fonction de leur volatilité, les acides à chaîne courte éluant plus tôt que les plus longs.
Identifiez les concentrations de différents SCFA en comparant les résultats avec les standards internes. Cela reflète la dégradation microbienne des exopolysaccharides dans des conditions proches de l’intestin
Pour étudier les effets de l’EPS sur la production de SCFA, ajoutez 1 millilitre de surnatant fermenté dans des tubes centrifugeuses de 2 millilitres et ajoutez 0,2 millilitre d’acide métaphosphorique à 25 poids par volume. Vortex pour mélanger soigneusement les solutions. Centrifugez les mélanges à 13 000 fois g pendant 20 minutes.
En attendant, préparez des solutions de 120 millimolaires d’acides acétique, propionique, butyrique, isobutyrique, valérique et isovalérique dans des tubes. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de chaque acide préparé dans un tube contenant 1,2 millilitre d’acide métaphosphorique à 25 % poids/volume et chargez-les dans la bouteille d’échantillon de l’instrument de chromatographie en phase gazeuse comme cocktails standards.
Retirez les tubes de la centrifugeuse et transférez les surnatants dans des tubes frais. Utilisez une seringue équipée d’un filtre de 0,22 micron pour filtrer les surnatants dans de nouveaux tubes pour une analyse en chromatographie gazeuse.