Imagerie en accéléré de la ségrégation des chromosomes chez des bactéries marquées par fluorescence

Commencez par un coussinet d’agarose riche en nutriments sur un cadre métallique contenant des bactéries exprimant des origines chromosomatiques fluorescentes et des microsphères fluorescentes.

Le coussinet d’agarose soutient l’attachement et la mobilité bactériennes, et les microsphères fluorescentes servent de référence pour suivre la ségrégation des chromosomes.

Ajoutez de l’huile d’immersion à la lentille objective dans la chambre d’incubation préchauffée d’un microscope à champ inversé.

Placez l’échantillon au-dessus de la lentille, puis concentrez-vous sur une région contenant plusieurs bactéries et au moins une microsphère fluorescente.

Lancer l’imagerie en accéléré et capturer à la fois des images en contraste de phase et en fluorescence.

L’origine de réplication marquée par fluorescence apparaît sous forme d’un amas lumineux près d’une extrémité de la cellule.

Lors de la division, l’origine se duplique ; un groupe reste à l’extrémité d’origine tandis que l’autre groupe migre vers l’extrémité nouvellement formée de la cellule.

Cette configuration permet de suivre la ségrégation des chromosomes sur plusieurs divisions et peut être adaptée pour visualiser des processus dynamiques similaires chez d’autres bactéries, y compris des espèces pathogènes lors des interactions avec l’hôte.

Pour réaliser la microscopie en accéléré, allumez le microscope et lancez le logiciel de contrôle du microscope. Sélectionnez l’objectif correct, les miroirs et filtres appropriés pour acquérir des images en contraste de phase ainsi que des images de protéines fluorescentes vertes, rouges fluorescentes ou fluorescentes jaunes. Ajoutez une goutte d’huile d’immersion de haute qualité sur la lentille de l’objectif et au fond de l’échantillon pré-incubé à 32 degrés Celsius.

Avec le côté du trou vers l’objectif, placez le cadre métallique avec l’échantillon sur la scène du microscope, puis fixez l’échantillon solidement dans le support de la scène. Concentrez-vous sur les cellules en rapprochant l’étage dans la direction Z de l’objectif. Lorsque l’huile sur l’objectif et l’échantillon entrent en contact, déplacez l’étage dans la direction X/Y.

Passez au logiciel Metamorph et ouvrez l’outil Acquirer. Sélectionnez Contraste de phase dans la liste déroulante Paramètres et réglez le temps d’exposition à 100 millisecondes. Cliquez sur Afficher en direct, Amener la cellule dans le plan focal, et déplacer la scène dans la direction X/Y jusqu’à ce que plusieurs cellules individuelles soient visibles dans le champ de vision.

Assurez-vous qu’au moins une microsphère fluorescente se trouve dans la région de vue afin d’aligner ultérieurement les images acquises. Ensuite, ouvrez l’assistant d’acquisition multidimensionnelle du logiciel de contrôle du microscope pour mettre en place une expérience en accéléré permettant au microscope d’acquérir des images à plusieurs longueurs d’onde et positions de scène si nécessaire.

Dans l’onglet principal, activez le time-lapse et Multiple Wavelengths. Des onglets supplémentaires apparaîtront sur le côté gauche de la fenêtre. Cliquez sur l’onglet Sauvegarder et sélectionnez Répertoire pour sélectionner un dossier vide sur le disque dur de l’ordinateur afin d’enregistrer les images acquises, puis activez Incrémenter le nom de base si le fichier existe pour s’assurer que les ensembles de données consécutifs ne remplacent pas les précédents. Attribuez à l’expérience un nom avec la date et le nom ou le titre de la souche de l’expérience.

Cliquez sur l’onglet time-lapse pour ajuster les paramètres du time-lapse, puis réglez l’intervalle de temps à 20 minutes et la durée à 24 heures. Le nombre de points de temps changera automatiquement. Maintenant, cliquez sur l’onglet Longueurs d’Onde.

Sélectionnez le nombre de longueurs d’onde à acquérir pour chaque image à chaque moment en changeant le nombre. Sélectionnez Autoriser la position AF mémorisée par matériel séparé pour chaque longueur d’onde. Cliquez sur l’onglet Première longueur d’onde depuis le haut.

Dans la liste déroulante Illumination, sélectionnez Contraste de phase. Sélectionnez 100 millisecondes pour l’exposition, et dans la liste déroulante Acquérir, sélectionnez Chaque point temporel. Désactivez Auto Expose dans la liste déroulante en sélectionnant Jamais et sélectionnez Chaque Acquisition dans la liste déroulante pour Focus automatique.

Réglez l’exposition pour chaque longueur d’onde comme cela vient de le démontrer en utilisant les paramètres suivants. Ensuite, pour acquérir des images de plusieurs positions de scène, dans l’onglet principal, activez Positions multiples de scène. Cliquez sur l’onglet Stage et cliquez sur le bouton Live pour voir le champ de vision.

Déplacez la scène dans la direction X/Y jusqu’à ce qu’un ROI soit visible dans le champ de vision. Enregistrez les coordonnées X et Y dans l’onglet Stage en cliquant sur le signe plus. Déplacez à nouveau la scène dans la direction X/Y jusqu’à ce qu’un nouveau ROI soit trouvé et enregistrez à nouveau les coordonnées en cliquant sur le signe plus.

Continuez jusqu’à ce que le nombre désiré de régions soit sauvegardé. Vérifiez une fois de plus que les cellules sont nettes en cliquant sur les différentes positions X et Y enregistrées, puis lancez l’autofocus matériel en appuyant sur AFC maintenu pour maintenir la position Z enregistrée constante au cours de l’expérience. Démarrez l’enregistrement en accéléré dans l’assistant d’acquisition multidimensionnelle du logiciel de contrôle du microscope en cliquant sur Acquérir.

Vérifiez que les cellules sont toujours nettes après les premiers points temporels des enregistrements en accéléré afin de maximiser la qualité des images et de les refocalizar si nécessaire.