Imagerie en accéléré de cellules vivantes de la prédation de Bdellovibrio bacteriovorus sur E. coli
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 3:21 min • February 26th, 2026
Commencez par une boîte de Petri contenant une co-culture de Bdellovibrio bacteriovorus, une bactérie prédatrice, et d’E. coli, sa proie, sous un coussinet d’agarose.
Le coussinet d’agarose maintient E. coli immobilisé, tandis que B. bacteriovorus reste mobile et envahit activement les cellules de proie.
Le prédateur exprime un marqueur cytoplasmique rouge et une balise fluorescente verte fusionnée à une sous-unité ADN polymérase pour la visualisation.
Fixez la plaque dans un support et appliquez de l’huile d’immersion à la base de la plaque et à l’objectif du microscope pour une résolution optimale.
Montez le support sur le microscope et configurez-le pour une détection de fluorescence à double canal.
Utilisez l’optique en champ clair pour localiser le plan focal et sélectionner plusieurs champs d’imagerie non superposés.
Définissez les paramètres de time-lapse pour capturer à la fois des images en champ clair et fluorescentes séquentiellement à des intervalles définis.
Cette méthode permet d’observer la prédation en commençant par l’attachement et l’invasion de la proie, suivie de la transformation des cellules de proie, de la croissance filamenteuse, de la septation, de la formation de la progéniture, et se terminant par la lyse des cellules de la proie.
Pour la microscopie à fleurescence en accéléré de la coculture, placez la plaque dans un porte-boîte de Petri de façon à ce qu’elle ne bouge pas pendant l’expérience, puis placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif inversé du microscope et une goutte au fond de la plaque. Montez le support sur l’étage du microscope dans la chambre du microscope inversé et, dans le logiciel du microscope, réglez le grossissement à 100X et la lentille polychrome à GFP et mCherry. À l’aide d’un oculaire dans Brightfield, localisez le plan focal et ouvrez le gestionnaire de points.
Déplacez la scène et utilisez le bouton Points de Marque pour enregistrer les coordonnées d’au moins 10 positions d’intérêt. Changez la valve de la caméra de l’oculaire vers le moniteur. Réglez le plan focal et cliquez sur le bouton Remplacer un point dans le gestionnaire de la liste de points pour calibrer chaque point.
Ouvrez le concepteur d’expériences et démarquez la boîte d’empilement des maladies. Sélectionnez les canaux fluorescents appropriés ainsi que les réglages optimaux d’éclairage, puis fixez les intervalles entre l’acquisition de l’image et le temps total de l’expérience. Activez la maintenance de la mise au point pour les positions choisies et sélectionnez le dossier de données dans lequel les fichiers image doivent être automatiquement sauvegardés.
Revérifiez tous les paramètres dans le contrôle logiciel du microscope et lancez l’expérience en accéléré. Après la première heure de l’expérience, vérifiez que toutes les positions de la scène sont toujours nettes. Lorsque l’expérience en accéléré est terminée, retirez la boîte de Petri et jetez la boîte de 35 millimètres avec un tampon d’agarose selon les protocoles de biosécurité appropriés.
Aperçu
Cet article décrit une méthode d'observation du comportement prédateur de Bdellovibrio bacteriovorus sur E. coli à l'aide de la microscopie à fluorescence en laps de temps. Le dispositif permet de visualiser différentes étapes de la prédation, notamment l'attachement, l'envahissement et la lyse des cellules proies.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Biologie cellulaire
- Microscopie de fluorescence
Contexte
- Bdellovibrio bacteriovorus est une bactérie prédatrice connue pour sa capacité à envahir et à consommer d'autres bactéries.
- E. coli sert d'organisme proie modèle dans cette étude.
- La microscopie à fluorescence en temps réel est une technique puissante permettant d'observer les processus biologiques dynamiques.
- L'utilisation de marqueurs fluorescents permet de visualiser des événements cellulaires spécifiques durant la prédation.
Objectif de l'étude
- Observer en temps réel le processus de prédation de B. bacteriovorus sur E. coli.
- Documenter les étapes de transformation et de lyse de la cellule proie.
- Affiner les techniques de microscopie afin d'améliorer la visualisation des interactions microbiennes.
Méthodes utilisées
- Culture mixte de B. bacteriovorus et de E. coli dans une boîte de Pétri.
- Application d'huile à immersion pour améliorer la résolution microscopique.
- Configuration du microscope pour la détection de fluorescence à deux canaux.
- Imagerie en laps de temps pour capturer les événements successifs durant la prédation.
Résultats principaux
- Visualisation réussie du processus de prédation, de l'attachement à la lyse.
- Documentation de la transformation des cellules d’E. coli durant la prédation.
- Identification des étapes clés du cycle de vie de B. bacteriovorus.
- Mise en place d'une méthode fiable pour les études futures sur la prédation microbienne.
Conclusions
- L'étude fournit des aperçus sur la dynamique de la prédation bactérienne.
- La microscopie à fluorescence en accéléré s'avère efficace pour observer les interactions microbiennes.
- Les résultats contribuent à la compréhension des relations prédateur-proie dans les écosystèmes microbiens.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle
La visualisation en temps réel des dynamiques de prédation bactérienne soutient la détection mécanistique des risques dans la validation des cibles antimicrobiennes, en permettant l'observation directe des interactions hôte-pathogène. Cette approche fournit des données quantitatives résolues dans le temps sur la lyse bactérienne et la libération de progéniture, renforçant la confiance prédictive dans les tests de criblage antimicrobien. La méthode fait le lien entre la biologie fondamentale et la microbiologie translationnelle en établissant un système pertinent pour la maladie afin d'évaluer de nouvelles stratégies antibactériennes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en visualisant en temps réel l'invasion bactérienne et la réplication intracellulaire.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle de cibles grâce à l'observation directe de la transformation des cellules proies et des cinétiques de lyse.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques des candidats antimicrobiens en corrélant les interventions moléculaires avec les résultats de la prédation.
Tests et développement de dosages
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des lectures normalisées et quantitatives par fluorescence pour le criblage haut-débit de composés antibactériens.
- Reproductibilité : La configuration avec proies immobilisées assure une sélection cohérente des champs et un maintien stable du focus tout au long des expériences en laps de temps.
- Évolutivité : Le gestionnaire de listes de points multiposition permet la collecte parallèle de données à partir de champs d’imagerie définis, facilitant l’analyse comparative.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Établit un modèle hôte-pathogène contrôlé pour étudier les dynamiques de prédation microbienne liées aux mécanismes d'infection.
- Continuité translationnelle : Relie les observations au stade de la découverte à l'évaluation préclinique de l'efficacité antibactérienne et du développement de la résistance.
- Décisions adaptées au risque : Fournit des critères visuels et quantitatifs pour des décisions d'orientation (aller ou ne pas aller) lors du développement précoce d'antimicrobiens.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de découverte d'agents antimicrobiens en permettant une surveillance en temps réel de la viabilité bactérienne et des modifications structurelles pendant l'exposition au composé, ce qui favorise l'identification et l'optimisation des candidats prometteurs.
- Biologie de la découverte : La visualisation directe des stades de prédation soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies dans les interactions hôte-microbe.
- Tri : La détection de fluorescence à double canal permet le suivi simultané de la localisation du prédateur et de la réplication de l'ADN de la proie, offrant des lectures d'essai multiplexées.
- Analytique : L'acquisition en prise de vue accélérée de l'attachement, de l'invasion, de la croissance filamenteuse, de la septation et de la lyse permet une analyse cinétique quantitative des effets antibactériens.
- Recherche translationnelle : L'observation en temps réel de la lyse des cellules proies facilite l'alignement des biomarqueurs avec le mécanisme d'action des antimicrobiens.
- Réutilisation en entreprise : Une configuration standardisée de microscopie et un étalonnage par liste de points permettent une réutilisation dans divers modèles de prédation et criblages de composés.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique concernant l'action antimicrobienne en permettant une visualisation directe de la dynamique de prédation bactérienne.
- Valeur opérationnelle : La configuration des proies immobilisées et le maintien du focus améliorent la reproductibilité et réduisent la variabilité expérimentale.
- Valeur stratégique : Permet des décisions fondées sur des données factuelles (aller ou ne pas aller plus loin) en reliant le traitement par composés à l'inhibition ou à l'augmentation observable de la prédation.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque des candidats antimicrobiens selon leur efficacité en temps réel et leurs profils de résistance.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie à fluorescence, en imagerie en temps réel et en techniques de co-culture bactérienne.
- Dépend d'un microscope inversé doté d'une fluorescence à deux canaux, compatible avec l'huile à immersion et équipé d'un système de stabilisation de la platine.
- Exige une standardisation de l'épaisseur des lames d'agarose et des protocoles d'immobilisation des proies entre les utilisateurs et les laboratoires.
- Les considérations d'adaptation incluent la compatibilité des marqueurs fluorescents avec différentes souches bactériennes et différents systèmes prédateur-proie.
- Les limites pratiques comprennent les risques de phototoxicité dus à une illumination prolongée et la diffusion dans l'agarose, qui peut compromettre l'immobilisation à long terme.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026