JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 3:21 min • February 26th, 2026
Commencez par une boîte de Petri contenant une co-culture de Bdellovibrio bacteriovorus, une bactérie prédatrice, et d’E. coli, sa proie, sous un coussinet d’agarose.
Le coussinet d’agarose maintient E. coli immobilisé, tandis que B. bacteriovorus reste mobile et envahit activement les cellules de proie.
Le prédateur exprime un marqueur cytoplasmique rouge et une balise fluorescente verte fusionnée à une sous-unité ADN polymérase pour la visualisation.
Fixez la plaque dans un support et appliquez de l’huile d’immersion à la base de la plaque et à l’objectif du microscope pour une résolution optimale.
Montez le support sur le microscope et configurez-le pour une détection de fluorescence à double canal.
Utilisez l’optique en champ clair pour localiser le plan focal et sélectionner plusieurs champs d’imagerie non superposés.
Définissez les paramètres de time-lapse pour capturer à la fois des images en champ clair et fluorescentes séquentiellement à des intervalles définis.
Cette méthode permet d’observer la prédation en commençant par l’attachement et l’invasion de la proie, suivie de la transformation des cellules de proie, de la croissance filamenteuse, de la septation, de la formation de la progéniture, et se terminant par la lyse des cellules de la proie.
Pour la microscopie à fleurescence en accéléré de la coculture, placez la plaque dans un porte-boîte de Petri de façon à ce qu’elle ne bouge pas pendant l’expérience, puis placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif inversé du microscope et une goutte au fond de la plaque. Montez le support sur l’étage du microscope dans la chambre du microscope inversé et, dans le logiciel du microscope, réglez le grossissement à 100X et la lentille polychrome à GFP et mCherry. À l’aide d’un oculaire dans Brightfield, localisez le plan focal et ouvrez le gestionnaire de points.
Déplacez la scène et utilisez le bouton Points de Marque pour enregistrer les coordonnées d’au moins 10 positions d’intérêt. Changez la valve de la caméra de l’oculaire vers le moniteur. Réglez le plan focal et cliquez sur le bouton Remplacer un point dans le gestionnaire de la liste de points pour calibrer chaque point.
Ouvrez le concepteur d’expériences et démarquez la boîte d’empilement des maladies. Sélectionnez les canaux fluorescents appropriés ainsi que les réglages optimaux d’éclairage, puis fixez les intervalles entre l’acquisition de l’image et le temps total de l’expérience. Activez la maintenance de la mise au point pour les positions choisies et sélectionnez le dossier de données dans lequel les fichiers image doivent être automatiquement sauvegardés.
Revérifiez tous les paramètres dans le contrôle logiciel du microscope et lancez l’expérience en accéléré. Après la première heure de l’expérience, vérifiez que toutes les positions de la scène sont toujours nettes. Lorsque l’expérience en accéléré est terminée, retirez la boîte de Petri et jetez la boîte de 35 millimètres avec un tampon d’agarose selon les protocoles de biosécurité appropriés.