Enregistrements postsynaptiques au dendrites afférentes Contacter cochléaires cellules ciliées internes: Communiqué multivésiculaires surveillance à une synapse ruban

L’objectif global de cette procédure est d’enregistrer l’activité post-synaptique au niveau des synapses afférentes des cellules ciliées internes. Ceci est accompli en exposant d’abord l’épithélium sensoriel d’une cochlée récemment retirée d’un rat décapité. La deuxième étape de la procédure consiste à positionner l’apical excisé, à allumer une lamelle modifiée et à la transférer dans la chambre d’enregistrement.

La troisième étape de la procédure consiste à localiser et à accéder à un bâton afférent avec une électrode enregistreuse. La dernière étape de la procédure consiste à former un joint étanche sur la membrane de fibres afférentes, puis à la rompre, en établissant toute la configuration cellulaire de la technique de patch clamp. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent l’apparition post-synaptique ou les potentiels d’une seule synapse à ruban grâce à l’électrophysiologie par patch clamp de cellule entière.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la dissection et la préparation du tissu cochléaire sont difficiles à apprendre et les petites fibres afférentes sont difficiles à reconnaître et à accéder. Avant de commencer la dissection, préparez une lamelle modifiée qui maintiendra la préparation en place pendant les enregistrements. À l’aide d’une lamelle en verre circulaire de huit à 12 millimètres, appliquez une goutte de protège-syle à moitié durci vers le bord de la lamelle.

Placez l’extrémité épaisse d’une fine épingle à insectes sur la lamelle. Tenez fermement la goupille anti-insectes contre le verre. À l’aide d’une pince, chauffez le protège-seuil contre une bobine chauffée pour qu’il durcisse.

Préparez 10 à 20 micro-électrodes comme décrit dans le texte d’accompagnement. Après le polissage au feu avec une micro-forge, la micro-électrode doit avoir un diamètre de pointe extérieur d’environ un micron. L’épaisseur finale de la paroi de la pipette est d’environ un tiers de micromètre après anesthésie et décapitation d’un rat de trois semaines.

Commencez la dissection en enlevant la peau en disséquant la tête et en enlevant le cerveau Pour exposer l’os temporal, retirez les deux os temporaux. Placez chaque os temporal dans une boîte de dissection propre contenant une solution extracellulaire standard. L’étape suivante consiste à retirer l’os, en encapsulant l’os temporal, de manière à exposer la cochlée.

Tenez fermement l’os temporal à la base à l’aide d’une paire de pinces. Identifiez la fenêtre ronde et ovale ainsi que la cochlée. Orientez la cochlée de manière à ce que la fenêtre ovale et le côté en spirale de la cochlée soient orientés vers le haut.

Retirez l’excès d’os autour de la cochlée. Utilisez une deuxième paire de pinces fines pour ébrécher l’os directement de la cochlée, en commençant par la zone qui est plus transparente que le reste de l’os. Ici, l’os est plus mince et plus facile à enlever.

Continuez à retirer l’os autour de la bobine apicale. Utilisez des ciseaux de dissection micros pour couper le modis sous le tour apical. Déconnectez ensuite le tour apical des tours inférieurs de la cochlée.

Prenez soin de protéger la bobine apicale. Il ne doit pas être tiré ou étiré. Enfin, retirez la tournure apicale de la cochlée sans trop déchirer le tissu.

À l’aide d’une pince fine, vous pouvez retirer le reste de l’os. L’étape suivante consiste à retirer la STR de l’oculis et de la membrane tiale. Retirez soigneusement le STR d’oculis, la bande de tissu brillant située à l’extérieur de la région des cellules ciliées.

Assurez-vous d’éviter d’enlever les cellules ciliées sensorielles, qui peuvent facilement se détacher avec la STR de l’oculis. Ensuite, utilisez des pinces fines pour détacher la membrane tiale. La membrane semi-transparente brillante qui se trouve au-dessus des cellules ciliées sensorielles coupe maintenant l’excès de tissu et d’os et aplatit la préparation avec la pince.

Ceci est nécessaire pour que le tissu puisse être placé uniformément sous une épingle. La dissection est maintenant terminée. Placez la préparation sous l’épingle sur la lamelle préparée en prenant soin de positionner l’épingle à l’écart des cellules ciliées une fois la dissection terminée.

À l’aide d’une pince, transférez la préparation dans la chambre d’enregistrement tout en maintenant une goutte de liquide extracellulaire sur la lamelle qui maintient le tissu cochléaire, commencez immédiatement la profusion avec une solution extracellulaire. Pour assurer une meilleure survie de la préparation, utilisez l’objectif 10 x du microscope ou l’objectif DIC 40x immersion dans l’eau. Pour localiser la préparation, orientez-la de manière à ce que les électrodes d’enregistrement puissent s’approcher des cellules ciliées internes à angle droit par rapport à leurs parois latérales.

Si la visibilité de la région basale des cellules ciliées internes est limitée parce que la préparation est enroulée, utilisez une électrode enregistreuse pour pousser le bord extérieur de la préparation contre la lamelle de verre. En prenant soin d’éviter d’appuyer sur les cellules ciliées internes elles-mêmes. Dans cette préparation, l’électrode supérieure maintient le bord extérieur de la préparation le long des marques d’électrode inférieures où se trouvent les bâtons afférents.

À titre de référence, l’appareil photo NC 70 Nuv Con affiche l’image agrandie Forex sur le moniteur pour évaluer si le tissu de la région interne des cellules ciliées est sain. Trouvez les faisceaux de cheveux comme point de référence et concentrez-vous pour trouver les noyaux. Concentrez-vous plus bas vers la base des cellules ciliées internes avec leurs terminaisons afférentes et remontez jusqu’à atteindre le niveau des noyaux sur le moniteur.

Localisez maintenant les bâtons afférents autour de la base des cellules ciliées internes. Les bâtons sont sphériques ou ellipsoïdaux, d’environ un micron de diamètre et sont de couleur claire avec un aspect brillant. Vous les trouverez en vous concentrant de haut en bas.

L’étape suivante consiste à dégager un chemin vers les fibres afférentes à l’aide d’une électrode d’enregistrement avec une pointe d’un micron remplie de solution intracellulaire. Appliquez une pression positive et utilisez le micromanipulateur pour manœuvrer l’électrode à la préparation. Utilisez cette électrode pour faire une incision dans la préparation au niveau de la base interne des cellules ciliées.

Poussez l’électrode entre la fine couche de cellules de soutien et les cellules ciliées internes en utilisant la pression positive pour forger une voie d’accès à la zone à la base des cellules ciliées internes. Retirez délicatement l’électrode et remplacez-la par une électrode fraîche avec une pointe d’un micron de diamètre remplie de solution intracellulaire. En utilisant une pression positive pour maintenir une pointe d’électrode propre, déplacez l’électrode d’enregistrement à travers le trou d’accès autour des cellules de support adjacentes vers le bâton afférent.

Assurez-vous que la pointe de l’électrode se trouve directement devant le bâton afférent, les bâtons offrent plus de résistance au mouvement de la pipette que les cellules de support et la membrane interne des cellules ciliées. Cette différence peut être ressentie lorsque la pipette est déplacée, déplacez la pipette de haut en bas et poussez pour vous assurer que le bhuton bouge. Cela indique que la pointe de la pipette et le bhuton sont dans le même plan de foyer avec l’électrode pressée contre le bhuton afférent Relâchez simultanément la pression positive et appliquez une aspiration pour former un joint giga ohm.

Appliquez de douces rafales d’aspiration pour rompre la membrane à l’intérieur de l’électrode afin d’obtenir un enregistrement de la cellule entière. Si la cellule patchée est un bâton afférent, de petits transitoires capacitifs sont observés dans le mode d’enregistrement de la cellule entière. Cette figure montre un transitoire typique enregistré à partir d’une fibre afférente.

Commencez à enregistrer l’activité synaptique. Si la fibre afférente ne présente pas d’activité spontanée, dépolarisez la cellule ciliée en appliquant une solution extracellulaire avec une concentration de potassium plus élevée. Cette figure montre les relations de tension de courant typiques pour les fibres AFF à gauche et les cellules ciliées internes à droite.

Les relations de tension de courant ont été enregistrées avec un potentiel de maintien de moins 84 millivolts avec des pas de tension de moins 124 millivolts à plus 36 millivolts par incréments de 10 millivolts. Les tensions sont montrées à droite de certaines pistes en se concentrant sur les relations de tension de courant d’une fibre afférente. Notez que l’apparition post-synaptique excitatrice ou EPC sont présentes pendant la majorité des étapes de tension.

Les EPC ont renversé un positif à environ six millivolts. Cet enregistrement a été effectué en présence de tétra-toxine pour bloquer les courants sodiques voltage-dépendants sans le bloqueur Les courants entrants de sodium à activation rapide seraient également apparus dans l’enregistrement et auraient identifié l’enregistrement comme un enregistrement de fibre afférente. Notez que le courant entrant s’active lentement à des tensions hyperpolarisantes.

Ce courant n’est pas présent dans les cellules ciliées internes ou les cellules de soutien et fournit une bonne indication que l’enregistrement provient d’une fibre afférente. Ces enregistrements montrent les relations de tension de courant pour une cellule ciliée interne. La flèche pointe vers l’activation rapide des courants de potassium vers l’extérieur à des potentiels positifs.

Ceux-ci sont suivis par des courants potassiques redresseurs retardés en raison d’un diamètre de pipette étroit et d’une résistance d’accès élevée. Les courants des cellules ciliées internes montrés ici sont plus petits que prévu pour obtenir des enregistrements précis des courants des cellules ciliées internes. Des pipettes avec des résistances d’accès plus faibles doivent être utilisées.

Cependant, les enregistrements présentés ici démontrent que les relations de tension de courant entre les cellules ciliées internes et les fibres afférentes peuvent être clairement distinguées. Cette figure montre les courants synaptiques enregistrés à partir d’une fibre afférente. Notez la taille et la forme variables des CPE.

Les enregistrements ont été effectués à température ambiante avec du tétra toin appliqué pour bloquer les courants de sodium voltage-dépendants. Cette figure montre des enregistrements simultanés d’une cellule ciliée interne et d’une matraque afférente en contact. Un pas de tension a été utilisé pour dépolariser la cellule ciliée interne et, en réponse, des courants calciques vers l’intérieur ont été enregistrés à partir de la cellule ciliée interne, l’influx de calcium entraîne la libération de neurotransmetteurs et l’activation d’EPC dans le bâton afférent.

Notez que la dépression synaptique apparaît lors d’une dépolarisation des cellules ciliées internes de 50 millisecondes lors de la tentative de cette procédure. Il est important de se rappeler de prendre soin de disséquer et de préparer le tissu cochléaire et de rester patient et optimiste lorsque vous essayez d’enregistrer à partir des terminaisons afférentes.