Enregistrements postsynaptiques au dendrites afférentes Contacter cochléaires cellules ciliées internes: Communiqué multivésiculaires surveillance à une synapse ruban

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer l'activité post-synaptique au niveau des synapses afférentes des cellules ciliées internes. Cela est réalisé en exposant d'abord l'épithélium sensoriel d'une cochlée récemment prélevée sur un rat sacrifié. La deuxième étape de la procédure consiste à positionner l'extrémité apicale excisée sur une lame de verre modifiée, puis à la transférer dans la chambre d'enregistrement.

La troisième étape de la procédure consiste à localiser et accéder à un bâtonnet afférent à l'aide d'une électrode d'enregistrement. La dernière étape de la procédure consiste à former un scellement étanche sur la membrane de la fibre afférente, puis à la rompre afin d'établir la configuration en cellule entière de la technique de scellement de membrane. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant l'apparition de potentiels post-synaptiques provenant d'une synapse en ruban unique par électrophysiologie en configuration de cellule entière.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la dissection et la préparation du tissu cochléaire sont difficiles à apprendre, et les petits fibres afférents sont difficiles à reconnaître et à atteindre. Avant de commencer la dissection, préparez un coverslip modifié qui maintiendra la préparation en place pendant les enregistrements. À l’aide d’un coverslip circulaire en verre de huit à douze millimètres, appliquez une goutte de Sylgard partiellement polymérisé vers le bord du coverslip.

Placez l'extrémité épaisse d'une fine épingle à insecte sur le couvre-objet. Tenez fermement l'épingle à insecte contre le verre. À l'aide de pinces, chauffez le joint d'étanchéité contre une résistance chauffante pour le fixer.

Préparez de 10 à 20 microélectrodes comme décrit dans le texte accompagnant. Après le polissage par flamme à l’aide d’un micro-foyer, la microélectrode doit avoir un diamètre externe d’environ un micron. L’épaisseur finale de la paroi de la pipette est d’environ un tiers de micromètre après anesthésie et décervelage d’un rat âgé de trois semaines.

Commencez la dissection en retirant la peau en disséquant la tête et en enlevant le cerveau. Pour exposer l'os temporal, retirez les deux os temporaux. Placez chaque os temporal dans un plat de dissection propre contenant une solution extracellulaire standard. L'étape suivante consiste à retirer l'os entourant l'os temporal afin d'exposer la cochlée.

Fixez fermement l'os temporal à la base à l'aide d'une pince. Repérez la fenêtre ronde, la fenêtre ovale et la cochlée. Orientez la cochlée de manière que la fenêtre ovale et le côté spiralé de la cochlée soient dirigés vers le haut.

Retirez l'excès d'os autour de l'oreille interne. Utilisez une deuxième paire de pinces fines pour écailler l'os directement sur l'oreille interne, en commençant par la zone plus transparente que le reste de l'os. L'os est ici plus mince et plus facile à enlever.

Continuez à retirer l'os autour du limbe apical. Utilisez des ciseaux de dissection microchirurgicaux pour couper la membrane modiolaire située sous le tour apical. Ensuite, détachez le tour apical des tours inférieurs de la cochlée.

Prenez soin de protéger la spirale apicale. Elle ne doit pas être tirée ni étirée. Enfin, retirez le tour apical de la cochlée sans trop déchirer le tissu.

Utilisez une pince fine pour enlever le reste de l'os. La prochaine étape consiste à retirer le STR des oculis et la membrane tiale. Retirez soigneusement le STR des oculis, la bande brillante de tissu située à l'extérieur de la région des cellules ciliées.

Veillez à ne pas retirer les cellules ciliées sensorielles, qui peuvent facilement se détacher avec la membrane STR d’oculis. Ensuite, utilisez une pince fine pour détacher la membrane tiale. La membrane brillante et translucide située au-dessus des cellules ciliées sensorielles étant maintenant exposée, retirez les tissus et os excédentaires et aplatissez la préparation à l’aide de la pince.

Ceci est nécessaire afin que le tissu puisse être placé uniformément sous une épingle. La dissection est maintenant terminée. Placez la préparation sous l'épingle sur la lame couvre-objet préparée en veillant à positionner l'épingle loin des cellules ciliées une fois la dissection terminée.

Utilisez une pince pour transférer le prélèvement dans la chambre d’enregistrement tout en maintenant une goutte de liquide extracellulaire sur le lamelle qui maintient le tissu cochléaire ; commencez immédiatement la perfusion avec la solution extracellulaire. Pour assurer une meilleure survie du prélèvement, utilisez l’objectif 10 x ou l’objectif DIC à immersion dans l’eau 40 x du microscope. Pour localiser le prélèvement, orientez-le de manière à ce que les électrodes d’enregistrement puissent approcher les cellules ciliées internes perpendiculairement à leurs parois latérales.

Si la visibilité de la région basale des cellules ciliées internes est limitée parce que le prélèvement est recourbé, utilisez une électrode d’enregistrement pour pousser le bord externe du prélèvement contre la lame de verre, en prenant soin d’éviter d’appuyer directement sur les cellules ciliées internes elles-mêmes. Dans ce montage, l’électrode supérieure maintient le bord externe du prélèvement, tandis que l’électrode inférieure indique l’emplacement des bastonnets afférents.

À titre de référence, la caméra NC 70 Nuv Con affiche sur le moniteur l'image agrandie du Forex afin d'évaluer si le tissu de la région des cellules ciliées internes est sain. Repérez les faisceaux de cils comme point de repère, puis focalisez en profondeur pour localiser les noyaux. Continuez à focaliser vers la base des cellules ciliées internes, au niveau de leurs terminaisons afférentes, puis remontez jusqu'à atteindre sur le moniteur le plan des noyaux.

Localisez maintenant les bâtonnets afférents autour de la base des cellules ciliées internes. Les bâtonnets sont sphériques ou ellipsoïdaux, mesurent environ un micron de diamètre et présentent une couleur claire avec un aspect brillant. Vous les trouverez en effectuant des mises au point vers le haut et vers le bas.

L'étape suivante consiste à dégager un passage vers les fibres afférentes à l'aide d'une électrode d'enregistrement possédant une pointe d'un micron remplie de solution intracellulaire. Appliquez une pression positive et utilisez le micromanipulateur pour diriger l'électrode vers le prélèvement. Utilisez cette électrode pour pratiquer une incision dans le prélèvement au niveau de la base des cellules ciliées internes.

En utilisant une pression positive, insérez l'électrode entre la fine couche de cellules de soutien et les cellules ciliées internes afin de créer un trajet d'accès vers la région située à la base des cellules ciliées internes. Retirez soigneusement l'électrode et remplacez-la par une électrode neuve dont la pointe a un diamètre d'un micron et est remplie de solution intracellulaire. En maintenant une pression positive pour garder la pointe de l'électrode propre, déplacez l'électrode d'enregistrement à travers le trou d'accès, en contournant les cellules de soutien adjacentes, en direction du bâtonnet afférent.

Veillez à ce que la pointe de l'électrode soit directement en face du bâtonnet afférent. Les bâtonnets offrent une résistance plus élevée au déplacement de la pipette que les cellules de soutien et la membrane de la cellule ciliée interne. Cette différence peut être ressentie lors du déplacement de la pipette ; déplacez la pipette vers le haut et vers le bas, et poussez pour vous assurer que le bâtonnet se déplace. Cela indique que la pointe de la pipette et le bâtonnet sont dans le même plan de focalisation, l'électrode étant appuyée contre le bâtonnet afférent. Relâchez simultanément la pression positive et appliquez une aspiration pour former un scellement de l'ordre du gigaohm.

Appliquez de légers coups d'aspiration pour rompre la membrane à l'intérieur de l'électrode afin d'obtenir un enregistrement en mode cellule entière. Si la cellule patchée est un bâtonnet afférent, de petits transitoires capacitifs sont observés en mode enregistrement de cellule entière. Cette figure montre un transitoire typique enregistré à partir d'une fibre afférente.

Commencez l'enregistrement de l'activité synaptique. Si la fibre afférente n'exhibe pas d'activité spontanée, dépolarisez la cellule ciliée en appliquant une solution extracellulaire à concentration plus élevée en potassium. Cette figure montre les relations courant-tension typiques pour les fibres AFF à gauche et les cellules ciliées internes à droite.

Les relations courant-tension ont été enregistrées à un potentiel de maintien de moins 84 millivolts, avec des paliers de tension allant de moins 124 millivolts à plus 36 millivolts par incréments de 10 millivolts. Les tensions sont indiquées à droite de certaines tracés, mettant l'accent sur les relations courant-tension provenant d'une fibre afférente. Remarquez que les courants post-synaptiques excitateurs, ou EPC, sont présents pendant la majeure partie des paliers de tension.

Les PCE ont inversé un potentiel positif d'environ six millivolts positifs. Cet enregistrement a été réalisé en présence de tétra-toxine afin de bloquer les courants sodiques activés par voltage ; sans ce bloqueur, des courants sodiques entrants rapides se seraient également manifestés dans l'enregistrement et auraient permis d'identifier celui-ci comme un enregistrement de fibre afférente. Remarquez le courant entrant lentement activé observé à des potentiels hyperpolarisants.

Ce courant n'est pas présent dans les cellules ciliées internes ni dans les cellules de soutien et constitue un bon indicateur du fait que l'enregistrement provient d'une fibre afférente. Ces enregistrements montrent les relations courant-tension pour une cellule ciliée interne. La flèche indique les courants potassiques sortants à activation rapide aux potentiels positifs.

Ces courants sont suivis par des courants potassiques rectificateurs différés dus à un diamètre de pipette étroit et à une résistance d'accès élevée. Les courants des cellules ciliées internes montrés ici sont plus faibles que prévu afin d'obtenir des enregistrements précis des courants des cellules ciliées internes. Des pipettes présentant des résistances d'accès plus faibles doivent être utilisées.

Cependant, les enregistrements présentés ici démontrent que les relations courant-tension des cellules ciliées internes et des fibres afférentes peuvent être clairement distinguées. Cette figure montre des courants synaptiques enregistrés à partir d'une fibre afférente. Remarquez la taille et la forme variables des PCE.

Les enregistrements ont été réalisés à température ambiante avec de la tétratoxine appliquée pour bloquer les courants sodiques dépendants du voltage. Cette figure montre des enregistrements simultanés provenant d'une cellule ciliée interne et d'un bâtonnet afférent en contact. Un palier de tension a été utilisé pour dépolariser la cellule ciliée interne et, en réponse, des courants calciques entrants ont été enregistrés ; l'entrée de calcium dans la cellule ciliée interne entraîne une libération de neurotransmetteur et l'activation de courants postsynaptiques excitateurs dans le bâtonnet afférent.

Remarquez la dépression synaptique apparaissant au cours d'une dépolarisation de 50 millisecondes de la cellule ciliée interne lors de la réalisation de cette procédure. Il est important de manipuler avec précaution lors de la dissection et de la préparation du tissu cochléaire, et de rester patient et optimiste lors de la tentative d'enregistrement des terminaisons afférentes.