Name: Enregistrements postsynaptiques au dendrites afférentes Contacter cochléaires cellules ciliées internes: Communiqué multivésiculaires surveillance à une synapse ruban (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Découvrez l'enregistrement patch-clamp en cellule entière au niveau des synapses afférentes des cellules ciliées internes chez le rat. Cette méthode permet d'étudier l'activité postsynaptique et les mécanismes de transmission auditive.

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Ce travail a été soutenu par une surdité Research Foundation Research Grant de EY et NIDCD DC006476 à EG et par NIDCD DC005211 au Centre pour l&#39;ouïe et l&#39;équilibre, l&#39;Université Johns Hopkins. Oeuvre d&#39;auteur Tim Phelps, Johns Hopkins University. LG a écrit le manuscrit initial, EY et LG a filmé la dissection et l&#39;enregistrement. Tous les auteurs ont fourni des chiffres exemplaire et a contribué à la rédaction du manuscrit.

<ol><li>Glowatzki, E., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitter+release+at+the+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transmitter release at the hair cell ribbon synapse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 147-154 (2002).</li>
<li>Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+calcium+dependence+of+transmitter+release+at+a+single+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Time course and calcium dependence of transmitter release at a single ribbon synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16341-16346 (2007).</li>
<li>Yi, E., Roux, I., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+HCN+channels+shape+excitatory+postsynaptic+potentials+at+the+inner+hair+cell+afferent+synapse+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic HCN channels shape excitatory postsynaptic potentials at the inner hair cell afferent synapse in the mammalian cochlea.</a> J Neurophysiol. 103 (5), 2532-2543 (2010).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+release+shape+the+postsynaptic+response+at+the+inner+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two modes of release shape the postsynaptic response at the inner hair cell ribbon synapse.</a> J Neurosci. 30 (12), 4210-4220 (2010).</li>
<li>LoGiudice, L., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ribbons+at+sensory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The role of ribbons at sensory synapses.</a> Neuroscientist. 15 (4), 380-391 (2009).</li>
<li>Singer, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nat Neurosci. 7 (8), 826-833 (2004).</li>
<li>Keen, E. C., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+characteristics+of+the+hair+cell%27s+afferent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5537-5542 (2006).</li>
<li>Li, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell%27s+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse.</a> J Neurosci. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li>
<li>Singer, J. H., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+depletion+and+synaptic+depression+at+a+mammalian+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Vesicle depletion and synaptic depression at a mammalian ribbon synapse.</a> J Neurophysiol. 95 (5), 3191-3198 (2006).</li>
<li>Suryanarayanan, A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+mediated+by+internal+calcium+stores+in+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission mediated by internal calcium stores in rod photoreceptors.</a> J Neurosci. 26 (6), 1759-1766 (2006).</li>
<li>Neef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanism+of+exocytosis+at+the+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanism of exocytosis at the hair cell ribbon synapse.</a> J Neurosci. 27 (47), 12933-12944 (2007).</li>
<li>Tritsch, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+spontaneous+activity+in+the+developing+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origin of spontaneous activity in the developing auditory system.</a> Nature. 450 (7166), 50-55 (2007).</li>
<li>Kros, C. J., Ruppersberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+potassium+current+in+inner+hair+cells+during+development+of+hearing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression of a potassium current in inner hair cells during development of hearing in mice.</a> Nature. 394 (6690), 281-284 (1998).</li>
<li>Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+of+frequency+representation+in+the+rat+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental changes of frequency representation in the rat cochlea.</a> Hear Res. 56 (1-2), 1-7 (1991).</li>
<li>Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li>
</ol>

L&#39;étape cruciale dans cette procédure est la dissection. Si le tissu est étiré ou endommagés lors de la dissection, les fibres afférentes ne survivra pas. Tissu de jeunes rats est plus élastique et indulgent. Nous trouvons que les jours postnataux 10 à 11 sont plus faciles à décortiquer et des expériences ont des taux de réussite plus élevé. Un degré significatif de la maturation cochléaire survient après la naissance, avec les rats commencent à entendre de partout jour postnatal 12 14. Par conséquent, à l&#39;âge où la dissection est plus facile, les synapses peuvent ne pas être en pleine maturité 4. La dissection décrite ici pour le rat est essentiellement le même pour les souris, la principale différence étant la plus petite taille de la cochlée de souris. Cette technique permet aux propriétés des synapses ruban pour être examinés dans des souris transgénique modifié 15. D&#39;autres modifications à cette technique sont: l&#39;ajout d&#39;un colorant fluorescent à la solution intracellulaire aux fibres étiquette 3; enregistrements jumelé avec la cellule ciliée interne pré-et postsynaptiques bouton afférents, permettant à la fonction de transfert entre pré et post-synaptiques des cellules à déterminer 2 et lâche- joint enregistrements extracellulaires à boutons afférentes pour éviter la perte de l&#39;intégrité cellulaire. La configuration d&#39;enregistrement extracellulaire est plus facile à atteindre que la configuration cellule entière et les expériences sont généralement plus durables.

Ci-dessus, l&#39;équipement de nos configurations électrophysiologiques utilisées pour l&#39;enregistrement des terminaisons afférentes.

enregistrements postsynaptiques au dendrites afférentes contacter cochléaires cellules ciliées internes: communiqué multivésiculaires surveillance à une synapse ruban

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

La synapse afférente entre les cellules ciliées internes (IHC) et la fibre du nerf auditif donne une place électrophysiologiquement accessible pour l&#39;enregistrement de l&#39;activité postsynaptique de la synapse un seul ruban 1-4. Synapses ruban de cellules sensorielles libération du neurotransmetteur en continu, dont le taux est modulé en réponse aux changements notés dans le IHC potentiel de membrane 5. Synapses à ruban ont été montré pour fonctionner par voie de communiqué multivésiculaires, où de multiples vésicules peuvent être libérés simultanément pour évoquer excitateurs courants postsynaptiques (EPSCs) de différentes amplitudes 1, 4, 6-11. Ni le rôle du ruban présynaptique, ni le mécanisme sous-jacent communiqué multivésiculaires est actuellement bien compris. L&#39;IHC est innervée par 10-20 fibres du nerf auditif, et tous les contacts de fibre l&#39;IHC avec un seul amyéliniques se termine pour former une synapse seul ruban. La petite taille de la CSI boutons afférentes contactant (environ 1 m de diamètre) permet des enregistrements avec une résolution temporelle exceptionnelle à faire. Par ailleurs, la technique peut être adaptée à enregistrer à partir de deux cellules pré-et post-synaptiques simultanément, permettant ainsi la fonction de transfert à la synapse à être étudiés directement 2. Cette méthode offre donc un moyen par lequel les aspects fondamentaux de la neurotransmission peut être étudiée, d&#39;une libération multivésiculaires à la fonction insaisissable du ruban dans les cellules sensorielles.

Whole-cell patch-clamp enregistrements de dendrites auditives fibres nerveuses au niveau des synapses du ruban des cellules ciliées internes de la cochlée de mammifère.

Enregistrements postsynaptiques au dendrites afférentes Contacter cochléaires cellules ciliées internes: Communiqué multivésiculaires surveillance à une synapse ruban

La synapse afférente entre la cellule ciliée interne (CCI) et la fibre du nerf auditif offre un site accessible électrophysiologiquement pour l'enregistrement du...

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer l'activité post-synaptique au niveau des synapses afférentes des cellules ciliées internes. Cela est réalisé en exposant d'abord l'épithélium sensoriel d'une cochlée récemment prélevée sur un rat décapité. La deuxième étape de la procédure consiste à positionner l'extrémité apicale excisée sur une lame de verre modifiée, puis à la transférer dans la chambre d'enregistrement.La troisième étape de la procédure consiste à localiser et accéder à un bâtonnet afférent à l'aide d'une électrode d'enregistrement. La dernière étape de la procédure consiste à former un scellement étanche sur la membrane de la fibre afférente, puis à la rompre afin d'établir la configuration en cellule entière de la technique de patch clamp. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant l'occurrence ou les potentiels post-synaptiques provenant d'une synapse en ruban unique par électrophysiologie en enregistrement en cellule entière par patch clamp.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la dissection et la préparation du tissu cochléaire sont difficiles à apprendre, et les petites fibres afférentes sont difficiles à reconnaître et à atteindre. Avant de commencer la dissection, préparez un couvre-objet modifié qui maintiendra la préparation en place pendant les enregistrements. À l’aide d’un couvre-objet circulaire en verre de huit à douze millimètres, appliquez une goutte de Sylgard partiellement polymérisé vers le bord du couvre-objet.Placez l'extrémité épaisse d'une fine épingle à insecte sur le couvre-objet. Maintenez fermement l'épingle à insecte contre le verre. À l'aide de pinces, chauffez le joint d'étanchéité contre une résistance chauffante pour le fixer.Préparez de 10 à 20 microélectrodes comme décrit dans le texte accompagnant. Après le polissage par flamme à l’aide d’un micro-foreur, la microélectrode doit présenter un diamètre externe d’environ un micron. L’épaisseur finale de la paroi de la pipette est d’environ un tiers de micromètre après anesthésie et décervelage d’un rat âgé de trois semaines.Commencez la dissection en retirant la peau en disséquant la tête et en enlevant le cerveau. Pour exposer l'os temporal, retirez les deux os temporaux. Placez chaque os temporal dans une boîte de dissection propre contenant une solution extracellulaire standard. L'étape suivante consiste à retirer l'os entourant l'os temporal afin d'exposer la cochlée.Fixez fermement l'os temporal à la base à l'aide d'une pince. Repérez la fenêtre ronde, la fenêtre ovale et la cochlée. Orientez la cochlée de manière que la fenêtre ovale et le côté spiralé de la cochlée soient dirigés vers le haut.Retirez l'excès d'os autour de la cochlée. Utilisez une deuxième paire de pinces fines pour écailler l'os directement depuis la cochlée, en commençant par la zone plus transparente que le reste de l'os. Là, l'os est plus mince et plus facile à enlever.Continuez à retirer l'os autour du limbe apical. Utilisez des ciseaux de dissection microchirurgicaux pour couper la membrane sous le tour apical. Ensuite, déconnectez le tour apical des tours inférieurs de la cochlée.Prenez soin de protéger la spire apicale. Elle ne doit pas être tirée ou étirée. Enfin, retirez la spire apicale de la cochlée sans trop déchirer le tissu.Utilisez une pince fine pour retirer le reste de l'os. L'étape suivante consiste à retirer le STR des oculis et la membrane tiale. Retirez soigneusement le STR des oculis, la bande brillante de tissu située à l'extérieur de la région des cellules ciliées.Veillez à ne pas retirer les cellules ciliées sensorielles, qui peuvent facilement se détacher avec la membrane STR d’oculis. Ensuite, utilisez une pince fine pour détacher la membrane tiale. La membrane brillante et partiellement transparente située au-dessus des cellules ciliées sensorielles étant exposée, retirez les tissus et os excédentaires et aplatissez la préparation à l’aide de la pince.Ceci est nécessaire afin que le tissu puisse être placé uniformément sous une épingle. La dissection est maintenant terminée. Placez la préparation sous l'épingle sur la lame couvre-objet préparée en veillant à positionner l'épingle loin des cellules ciliées une fois la dissection terminée.Utilisez une pince pour transférer le prélèvement dans la chambre d’enregistrement tout en maintenant une goutte de liquide extracellulaire sur le lamelle qui maintient le tissu cochléaire ; commencez immédiatement la perfusion avec la solution extracellulaire. Pour assurer une meilleure survie du prélèvement, utilisez l’objectif 10 x ou l’objectif DIC à immersion dans l’eau 40 x du microscope. Pour localiser le prélèvement, orientez-le de manière à ce que les électrodes d’enregistrement puissent approcher les cellules ciliées internes perpendiculairement à leurs parois latérales.Si la visibilité de la région basale des cellules ciliées internes est limitée parce que le prélèvement est recourbé, utilisez une électrode d’enregistrement pour pousser le bord externe du prélèvement contre la lame de verre, en prenant soin d’éviter d’appuyer directement sur les cellules ciliées internes elles-mêmes. Dans ce montage, l’électrode supérieure maintient le bord externe du prélèvement, tandis que l’électrode inférieure indique l’emplacement des bastonnets afférents.Pour référence, la caméra NC 70 Nuv Con affiche sur le moniteur l'image agrandie du Forex afin d'évaluer si le tissu de la région des cellules ciliées internes est sain. Repérez les faisceaux ciliés comme point de repère, puis focalisez en profondeur pour localiser les noyaux. Continuez à focaliser vers la base des cellules ciliées internes, au niveau de leurs terminaisons afférentes, puis remontez jusqu'à atteindre sur l'écran le plan des noyaux.Localisez maintenant les bâtonnets afférents autour de la base des cellules ciliées internes. Les bâtonnets sont sphériques ou ellipsoïdaux, d'un diamètre d'environ un micron, et de couleur claire avec un aspect brillant. Vous les trouverez en effectuant des mises au point vers le haut et vers le bas.L'étape suivante consiste à dégager un passage vers les fibres afférentes à l'aide d'une électrode d'enregistrement possédant une pointe d'un micron remplie de solution intracellulaire. Appliquez une pression positive et utilisez le micromanipulateur pour diriger l'électrode vers le prélèvement. Utilisez cette électrode pour pratiquer une incision dans le prélèvement au niveau de la base des cellules ciliées internes.En utilisant une pression positive, insérez l'électrode entre la fine couche de cellules de soutien et les cellules ciliées internes afin de créer un trajet d'accès vers la région située à la base des cellules ciliées internes. Retirez soigneusement l'électrode et remplacez-la par une électrode neuve dont la pointe a un diamètre d'un micron et est remplie de solution intracellulaire. En maintenant une pression positive pour garder la pointe de l'électrode propre, déplacez l'électrode d'enregistrement à travers le trou d'accès, en contournant les cellules de soutien adjacentes, en direction du bâtonnet afférent.Veillez à ce que la pointe de l'électrode soit directement en face du bâtonnet afférent. Les bâtonnets offrent une résistance plus élevée au déplacement de la pipette que les cellules de soutien et la membrane de la cellule ciliée interne. Cette différence peut être ressentie lors du déplacement de la pipette ; déplacez-la vers le haut et vers le bas, puis poussez pour vous assurer que le bâtonnet se déplace. Cela indique que la pointe de la pipette et le bâtonnet sont dans le même plan de focalisation, l'électrode étant appuyée contre le bâtonnet afférent. Relâchez simultanément la pression positive et appliquez une aspiration pour former un scellement de gigaohm.Appliquez de légers coups d'aspiration pour rompre la membrane à l'intérieur de l'électrode afin d'obtenir un enregistrement en mode cellule entière. Si la cellule patchée est un bâtonnet afférent, de petits transitoires capacitifs sont observés en mode enregistrement de cellule entière. Cette figure montre un transitoire typique enregistré à partir d'une fibre afférente.Commencez l'enregistrement de l'activité synaptique. Si la fibre afférente n'exhibe pas d'activité spontanée, dépolarisez la cellule ciliée en appliquant une solution extracellulaire à concentration plus élevée en potassium. Cette figure montre les relations courant-tension typiques pour les fibres AFF à gauche et les cellules ciliées internes à droite.Les relations courant-tension ont été enregistrées à un potentiel de maintien de moins 84 millivolts, avec des paliers de tension allant de moins 124 millivolts à plus 36 millivolts par incréments de 10 millivolts. Les tensions sont indiquées à droite de certaines tracés, mettant l'accent sur les relations courant-tension provenant d'une fibre afférente. Remarquez que les courants post-synaptiques excitateurs, ou EPC, sont présents pendant la majeure partie des paliers de tension.Les PCE ont inversé un potentiel d'environ +6 mV. Cet enregistrement a été réalisé en présence de tétraodotoxine afin de bloquer les courants sodiques activés par le voltage ; sans ce bloqueur, des courants sodiques entrants rapidement activés seraient également apparus dans l'enregistrement, indiquant qu'il s'agissait d'un enregistrement de fibre afférente. Remarquez le courant entrant lentement activé aux potentiels hyperpolarisants.Ce courant n'est pas présent dans les cellules ciliées internes ou les cellules de soutien et constitue un bon indicateur que l'enregistrement provient d'une fibre afférente. Ces enregistrements montrent les relations courant-tension pour une cellule ciliée interne. La flèche indique les courants potassiques sortants à activation rapide aux potentiels positifs.Ces courants sont suivis par des courants potassiques rectificateurs différés dus à un diamètre de pipette étroit et à une résistance d'accès élevée. Les courants des cellules ciliées internes montrés ici sont plus faibles que prévu afin d'obtenir des enregistrements précis des courants des cellules ciliées internes. Des pipettes présentant des résistances d'accès plus faibles doivent être utilisées.Cependant, les enregistrements présentés ici démontrent que les relations courant-tension des cellules ciliées internes et des fibres afférentes peuvent être clairement distinguées. Cette figure montre des courants synaptiques enregistrés à partir d'une fibre afférente. Remarquez la taille et la forme variables des PEC.Les enregistrements ont été réalisés à température ambiante avec de la tétratoxine appliquée pour bloquer les courants sodiques dépendants du voltage. Cette figure montre des enregistrements simultanés provenant d'une cellule ciliée interne et d'un bâtonnet afférent en contact. Un palier de tension a été utilisé pour dépolariser la cellule ciliée interne et, en réponse, des courants calciques entrants ont été enregistrés ; l'entrée de calcium dans la cellule ciliée interne entraîne la libération de neurotransmetteurs et l'activation de courants postsynaptiques excitateurs dans le bâtonnet afférent.Remarquez que la dépression synaptique apparaît au cours d'une dépolarisation de 50 millisecondes de la cellule ciliée interne. Il est important de manipuler avec précaution lors de la dissection et de la préparation du tissu cochléaire, et de rester patient et optimiste lors de la tentative d'enregistrement des terminaisons afférentes.

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