Génération d’une monocouche colonoïde humaine avec fonction barrière pour étudier les interactions hôte-pathogène

Commencez par une plaque à puits multiples contenant un insert de puits recouvert de collagène.

Ajoutez un milieu d’expansion au puits.

Les nutriments du milieu favorisent la prolifération cellulaire, tandis que les inhibiteurs de différenciation maintiennent un état de type tige.

Ajouter une suspension de groupes cellulaires épithéliales issus de cultures de cellules souches du côlon dans le puits et incuber.

Les cellules adhèrent à la surface recouverte de collagène et reçoivent des nutriments des compartiments supérieur et inférieur.

Les inhibiteurs empêchent la différenciation cellulaire et facilitent la prolifération des grappes cellulaires.

À l’aide d’un microscope à contraste de phase, observez la culture.

Une fois la monocouche formée, remplacer le milieu de culture par un milieu frais sans inhibiteurs de différenciation cellulaire.

Cela facilite la différenciation des cellules en cellules épithéliales du côlon mature avec des jonctions serrées.

Ces cellules sécrètent du mucus et développent une monocouche fonctionnelle qui imite la barrière intestinale physiologique pour les études d’interaction hôte-pathogène.

Pipettez 600 microlitres de milieu d’expansion dans l’espace sous chaque insert. Pipeter 100 microlitres de suspension cellulaire du flacon dans chaque insert.

Retournez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire et laissez-la sans être dérangée pendant au moins 12 heures. Évitez de secouer ou d’incliner brusquement l’assiette. Après l’incubation, placez la plaque sur un microscope optique à contraste de phase avec une lentille objective de 2,5 à 10 fois.

Renouveler avec un milieu de culture sans inhibiteurs pour arrêter le traitement d’inhibition. Continuez à rafraîchir le milieu tous les deux à trois jours jusqu’à la confluence.