Génération de sphéroplastes à partir de bactéries à Gram négatif

Prenez des milieux contenant un antibiotique bloquant la division cellulaire.

Ininoculez-le avec des bactéries Gram-négatives en forme de bâtonnet.

Incubez avec des secousses.

En présence de l’antibiotique, les bactéries continuent de croître sans se diviser et forment de longs filaments.

Collectez la culture et centrifugez-la à basse température. Jetez le surnageant et lavez les filaments avec une solution de saccharose pour éviter la lyse.

Jetez la solution de saccharose.

Ajoutez un tampon suivi d’enzymes et d’EDTA. L’EDTA affaiblit la membrane externe, permettant à la lysozyme d’entrer et de décomposer la couche de peptidoglycane.

Cela retire la paroi cellulaire, permettant à la cellule bactérienne de rétrécir. La DNase I décompose l’ADN chromosomique libéré des cellules et empêche l’agglomération cellulaire.

Ajoutez une solution hypotonique avec un léger tourbillonnage, permettant à la cellule d’aspirer de l’eau.

Les membranes flexibles permettent à la cellule de prendre une forme sphérique appelée sphéroplaste.

Transférez une aliquote contenant les sphéroplastes dans deux tubes avec une solution isotonique refroidie pour stabiliser les sphéroplastes.

Pour préparer des sphéroplastes à E . coli à Gram négatif, diluez la culture nocturne à un ratio de 1 pour 100 dans 25 millilitres de TSB dans une fiole de 250 millilitres, puis remettez les bactéries dans l’incubateur secoué pendant 2,5 heures supplémentaires. Lorsque la solution atteint une densité optique de 0,5 à 0,8 à 600 nanomètres, diluer la culture à un ratio de 1 pour dix dans du TSB frais dans un nouveau flasque de 250 millilitres pour une seconde incubation de 2,5 heures avec une concentration effective finale de 60 microgrammes par millilitre de céphalexine.

Produire des filaments monocellulaires d’environ 50 à 150 micromètres de long, tels que visualisés au microscope optique à un grossissement de 1000 fois. Centrifugez la solution bactérienne pour récolter les filaments et décantez le surnageant. Lavez les filaments avec une légère addition d’un millilitre de saccharose de 0,8 molaire, en veillant à ne pas déranger la pellete.

Après une minute, jetez le surnageant sans déranger la pastille, et ajoutez les réactifs indiqués dans leur ordre respectif aux filaments. Après dix minutes à température ambiante, ajoutez progressivement un millilitre de solution A sur une période d’une minute, tout en faisant légèrement tourner la solution à la main. Incubez la solution pendant quatre minutes à température ambiante, puis séparez la suspension filamenteuse en deux aliquotes égales entre deux tubes coniques de 15 millilitres contenant sept millilitres de la solution B à quatre degrés Celsius. Ensuite, pelletez les filaments par centrifugation, et utilisez une pipette sérologique pour retirer soigneusement tous les filaments de surnageant sauf un à deux millilitres sans déranger les granules.

Utilisez une micropipette p1000 pour resuspendre doucement les granulés. Vérifiez une petite aliquote de l’échantillon pour la formation de sphéroplastes par microscopie optique. Le sphéroplaste peut ensuite être conservé à moins 20 degrés Celsius pendant une semaine ou jusqu’à ce qu’ils aient traversé trois cycles de congélation et de décongélation.