Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 3:47 min • February 26th, 2026
Commencez par deux micro-plats à fond de verre contenant des suspensions d’une bactérie formatrice de biofilms.
La plaque de traitement contient une enzyme active perturbatrice de la signalisation, tandis que le témoin inclut l’enzyme inactivée.
Couvrez les plats et faites couver pour permettre l’adhérence bactérienne à la surface du micro-plat.
Lavez pour éliminer les cellules non adhérentes, puis introduisez un nouveau milieu contenant les enzymes et incubez.
Dans la boîte témoin, les bactéries communiquent par des molécules de signalisation et produisent des substances polymériques extracellulaires (EPS), formant un biofilm.
L’enzyme active dégrade les molécules de signalisation, perturbant leur fonction et réduisant la formation de biofilms.
Reconstituer avec un nouveau milieu et incuber davantage pour renforcer les effets perturbateurs de biofilms de l’enzyme.
Retirez le milieu, ajoutez des lectines marquées sous fluorescence et incubez pour permettre la liaison des lectines à l’EPS.
Lavez-le pour éliminer toute lectine non liée.
Incubez avec un fixateur pour préserver l’architecture du biofilm, puis rincez la plaque.
Acquérir des images de microscopie confocale pour évaluer la suppression enzymatique de la formation de biofilms.
Pour réaliser une microscopie à balayage laser confocal, ou CLSM, des biofilms S1 d’A. baumannii , cultivez une culture de 5 millilitres d’A. baumannii S1 en LB à 30 degrés Celsius dans un incubateur secouant pendant 16 heures. Ajustez la culture d’A. baumannii S1 à un OD600 de 0,8.
Ensuite, utilisez du LB frais contenant 1,2 milligramme par millilitre d’enzyme GKL purifiée pour diluer la culture, de 1 à 100, et ajoutez 1 millilitre à un micro-plat à fond en verre de 35 millilitres. Couvrez le microplat d’un couvercle, placez-le dans un récipient plastique de 10 litres et scellez-le avant d’incuber le plat à 30 degrés Celsius pendant trois heures. Après avoir retiré doucement le milieu, ajoutez 1 millilitre de substrat frais contenant 30 microlitres d’enzyme GKL purifiée, puis éclovez à 30 degrés Celsius pendant 21 heures supplémentaires.
Retirez doucement le milieu une seconde fois et remplacez par un autre millilitre d’enzyme GKL dans un milieu frais. Incubez à 30 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, retirez doucement le milieu et ajoutez 500 microlitres de 5 microgrammes par millilitre d’agglutinine conjuguée du germe de blé Alexa Fluor 488 dissous dans le HBSS.
Incubez la micro-antenne à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour colorer les biofilms. Pour fixer les biofilms, ajoutez 500 microlitres de formaldéhyde à 3,7 % dissous dans le HBSS et éclovez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Utilisez 2 millilitres de HBSS pour laver le microvaisselle une fois, puis retirez complètement la solution.
Conservez le plat dans le noir à 4 degrés Celsius avant l’imagerie CLSM. Pour l’imagerie et l’analyse CLSM, utilisez un objectif 63 X pour générer 97 stacks par image avec un intervalle de 0,21 micron par stack.