Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 3:41 min • February 26th, 2026
Prenez une suspension de bactéries pathogènes.
Ajoutez la suspension à une culture adhérée de macrophages dérivés de la moelle osseuse ou de cellules BMDM et incubez.
Les bactéries utilisent leurs protéines de surface pour se lier aux récepteurs des cellules hôtes, facilitant ainsi l’adhésion.
Rincez avec un tampon pour éliminer les bactéries non adhérées.
Ajoutez un nouveau substrat et incubez.
Les bactéries adhérées sont ensuite intériorisées par la cellule hôte.
Ajoutez un antibiotique pour éliminer les bactéries non internalisées.
Jetez le support et lavez avec un tampon.
Ajoutez de l’eau froide pour lyser la cellule hôte, libérant ainsi le contenu cellulaire, le noyau et les bactéries intériorisées.
Collectez le lysat cellulaire et centrifugez pour précipiter les débris cellulaires.
Collectez le surnageant contenant la bactérie. Faites-le passer dans un dispositif de filtration pour capturer les bactéries intactes.
Pliez le papier filtre et placez-le dans un tube.
Congélation rapide dans de l’azote liquide pour préserver l’intégrité cellulaire.
Conserver dans des conditions froides pour une utilisation ultérieure.
En utilisant 0,5 millilitre de la suspension bactérienne lavée, infectez chaque plaque macrophage. Si vous utilisez plusieurs plaques, espacez les infections de 15 minutes pour permettre la récolte individuelle de chaque plaque à la fin de l’infection. Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, utilisez le PBS pour laver deux fois les cellules infectées afin d’éliminer les bactéries non attachées, puis ajoutez 30 millilitres de milieu BMDM préchauffé.
Incubez pendant 30 minutes pour permettre aux bactéries de s’intérioriser. Une heure après l’infection, ajoutez la gentamicine à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre pour éliminer les bactéries extracellulaires restantes. Montez l’appareil filtrant en plaçant une tête filtrante sur une fiole de liquide collecteur avec un port de sortie sous vide.
Ensuite, placez un filtre de 0,45 micron sur la tête du filtre, suivi d’un entonnoir cylindrique, et utilisez une collière métallique pour fixer les différentes pièces. Six heures après l’infection, examinez la monocouche cellulaire au microscope avant la prélèvement. En travaillant avec une plaque à la fois pour récolter les bactéries, utilisez le PBS pour laver les cellules infectées.
Ensuite, pour lyser les cellules macrophages, ajoutez 20 millilitres d’eau sans ARN glacée, et utilisez rapidement mais prudemment un grattoir cellulaire pour gratter les cellules de la plaque. Après avoir rassemblé les cellules dans un tube conique de 50 millilitres, faites tourner pendant 30 secondes, puis centrifugez à 800 fois g et 4 degrés Celsius pendant 3 minutes pour retirer les noyaux des macrophages. Pour collecter les bactéries, il faut faire passer le surnageant à travers le filtre à l’aide du système à vide.
Ensuite, avec une pince à épiler, roulez le filtre et transférez-le rapidement dans un tube conique de 15 millilitres. Utilisez immédiatement de l’azote liquide pour congeler instantanément le tube.