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Commencez par des cultures de Streptococcus mutans, une bactérie pathogène orale, et de Candida albicans, un agent pathogène fongique opportuniste.
Transférez les colonies isolées dans un milieu riche en nutriments et éclovez pendant la nuit pour assurer une croissance active.
Centrifugeuse pour pelleter les cellules. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans du sérum physiologique stérile jusqu’à une concentration définie.
Prenez une plaque multipuits recouverte d’une solution salivaire humaine pour imiter l’environnement oral.
Ajoutez C. albicans et incubez pour permettre l’attache au revêtement salivaire. Lavez avec du sérum physiologique stérile pour éliminer les cellules non adhérentes.
Ajoutez du sérum inactivé à la chaleur et incubez pour stimuler le développement des hyphes. Rince l’excès de sérum.
Introduire S. mutans, puis un milieu riche en saccharose et incuber. S. mutans sécrète de la glucosyltransférase, qui se lie à C. albicans mannans.
Cette enzyme catalyse le saccharose en glucanes à la surface fongique, ancrant les bactéries aux hyphes et favorisant la prolifération ainsi que la formation de la matrice.
Cette méthode permet de modéliser la synergie microbienne dans la pathogénie orale, par biofilms inter-règnes.
Faites pousser S. mutans et C. albicans sur des plaques d’agar sanguin à 37 degrés Celsius dans des conditions aérobies.
Ensuite, transférez des colonies individuelles de chaque organisme dans des tubes à essai remplis de 5 millilitres d’infusion cérébrale-cérébrale, puis les faites pousser pendant 18 heures supplémentaires.
Le lendemain, centrifugez les cultures à 1 200 fois g pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Resuspendez les cellules dans une solution physiologique et ajustez la OD550 à 0,5 pour C . albicans et S. mutans.
Puis diluez la suspension de S. mutans de 1 à 10 pour obtenir des concentrations équivalentes. Pipeter 50 microlitres de solution salivaire stérile dans les puits d’une plaque de fond optique de 96 puits pour la microscopie.
Incubez la plaque pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, puis lavez la plaque trois fois avec 100 microlitres de solution physiologique stérile, et videz les puits.
Ajoutez 100 microlitres de C. albicans suspension dans chaque puits, faites couver la plaque à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes, puis lavez le puits trois fois avec du sérum physiologique.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur dans chaque puits. Faites couver l’assiette pendant deux heures, puis lavez-la trois fois avec du sérum physiologique.
Videz les puits mais laissez un réservoir de 20 microlitres pour éviter des forces de cisaillement excessives. Ajoutez 100 microlitres de suspension de S. mutans et 150 microlitres de BHI avec 5 % de saccharose dans chaque puits. Ensuite, faites couver la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures ou plus.
Lors de la culture de biofilms plus anciens, remplacez le support quotidiennement. À la fin de la phase de croissance croisée, lavez la plaque cinq fois avec une solution physiologique stérile.