Immunocoloration des microlésions remplies de bactéries dans une section de tissu cardiaque de souris pour imagerie

Commencez par une lame contenant une section de tissu cardiaque fixée chimiquement provenant d’une souris infectée par Streptococcus pneumoniae, une bactérie pathogène.

Cette infection provoque la formation de microlésions extracellulaires remplies de bactéries dans les muscles cardiaques.

Lavez la section avec un tampon pour éliminer tout fixateur résiduel.

Appliquez un détergent non ionique pour perméabiliser les membranes cellulaires de l’hôte.

Lavez à nouveau pour éliminer tout reste de détergent.

Incubez la coupe avec un agent bloqueant pour bloquer les sites de liaison non spécifiques.

Rincez pour éliminer l’agent bloqueant non lié.

Introduisez un anticorps primaire qui se lie au polysaccharide capsulaire de la bactérie.

Lavez-vous pour éliminer tout anticorps non lié, puis ajoutez un anticorps secondaire vert marqué par fluorophore qui se lie à l’anticorps primaire.

Contre-coloration avec un colorant nucléaire pour marquer les noyaux de la cellule hôte.

Lavez la section et montez-la avec un support de montage.

Observez la section à l’aide d’une microscopie confocale pour visualiser les bactéries marquées dans les microlésions.

En utilisant une section cardiaque de 5 microns sur des lames en verre chargées positivement, congelez d’abord les sections, puis décongelez-les et laissez-les sécher à l’air. Fixez les lames dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius. Ensuite, retirez le fixateur avec trois lavages et un PBS pendant cinq minutes par lavage.

Suivez par la perméabilisation du tissu avec 0,2 % de Triton X-100 dans PBS pendant 15 minutes. Retirez la lessive avec trois lavages supplémentaires en PBS pur. Ensuite, bloquez le tissu avec du sérum de chèvre à 10 % dans le PBS pendant une heure. Après un rinçage en PBS, couvrez la section avec un antisérum pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Traitez les témoins négatifs avec un antisérum naïf pour lapins.

Comme le tissu cardiaque absorbe facilement la coloration immunofluorescente XI, ce qui entraîne des niveaux de fond élevés, la concentration en temps d’incubation pour différents types d’anticorps devra probablement être optimisée.

Deux heures plus tard, lavez l’anti-sérum avec du PBS. Ensuite, remplacez la solution par un anticorps secondaire et laissez les lames incuber à 37 degrés Celsius pendant encore 30 minutes. Maintenant, appliquez du DAPI à 5 milligrammes par millilitre et lavez les lames avec du PBS. Enfin, montez les lames dans FluorSave et imagez-les avec une microscopie confocale.