Essai de résistance à l’éthanol pour évaluer l’intégrité de la matrice de biofilm

Prenons des biofilms pathogènes dérivés de bactéries cultivés sur un agar nutritif.

Le biofilm non traité présente des bactéries densément compactes au sein d’une matrice extracellulaire protectrice.

Le biofilm traité par inhibiteur présente des cellules faiblement associées au sein d’une matrice clairsemée.

Divisez chaque biofilm en deux, puis exposez une moitié à un tampon en tant que témoin, et l’autre à l’éthanol pour imposer un stress antimicrobien.

Dans le biofilm non traité exposé à l’éthanol, la matrice dense réduit la diffusion de l’éthanol et limite la pénétration cellulaire, ce qui réduit la destruction bactérienne.

Dans le biofilm exposé à l’éthanol et traité par inhibiteurs, la matrice clairsemée permet à l’éthanol de pénétrer plus facilement, ce qui entraîne une plus grande destruction bactérienne.

Centrifugez les tubes et retirez le surnageant. Ajoutez un tampon et sonicez pour disperser les cellules.

Placez les suspensions diluées et incubez pour permettre la croissance de bactéries viables.

Compter les unités formant des colonies (CFU) ; moins d’UFC provenant du biofilm exposé à l’éthanol traité par un inhibiteur confirment que l’intégrité de la matrice est essentielle à la résistance à l’éthanol.

Prenez une lame de rasoir propre et coupez les colonies de biofilm en deux parties égales à l’aide du gabarit. Soulevez soigneusement une moitié de la colonie avec une spatule propre, puis transférez-la dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre, contenant 500 microlitres de PBS.

Prenez la seconde moitié de la colonie et transférez-la dans un tube micro-centrifuge contenant 500 microlitres d’éthanol à 50 %. Celles-ci seront utilisées pour évaluer la résistance aux agents stérilisants. Ensuite, prenez de même la première moitié de la colonie traitée à la D-leucine et placez-la dans le PBS.

Ensuite, prenez la seconde moitié de cette colonie et transférez-la dans de l’éthanol. Incubez tous les tubes contenant les moitiés du biofilm pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, centrifuge-les pendant cinq minutes à 18 000 fois g.

À l’aide d’une pipette, retirez soigneusement le surnageant. Ajoutez 300 microlitres de PBS, puis soniez les cellules à faible intensité, avec un micro-sonicateur à pointe. Ajoutez 700 microlitres supplémentaires de PBS pour un volume final d’un millilitre.

Ensuite, effectuez une dilution en série de 10 à moins 7 dans PBS. Prenez 100 microlitres d’une des dilutions et inocularez une plaque LB d’agar à 1,5 %. Répétez cette étape pour deux autres dilutions par échantillon.

Étalez l’inoculum à l’aide de billes de verre, puis incubez les plaques toute la nuit à 30 degrés Celsius. Examinez les plaques et comptez les unités formant la colonie, ou UFC. Après avoir calculé la valeur de l’UFC par millilitre, calculez le pourcentage de survivants dans les traitements PBS par rapport aux traitements à l’éthanol.