Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 2:32 min • February 26th, 2026
Incubez un verre de couverture à chambre contenant des bactéries adhérées dans un milieu complété avec un filtrat de crachats dérivé du patient et uniquement dans le milieu.
Le filtrat de crachats contient des composants dérivés de l’hôte qui stimulent les voies de signalisation bactériennes, déclenchant la production de matrices et la formation de biofilms.
Une fois les biofilms formés, il faut éliminer le milieu contenant des bactéries flottantes libres et des composants résiduels dérivés de l’hôte.
Lavez-le avec un tampon pour éliminer les bactéries faiblement attachées.
Ajoutez un mélange colorant contenant des colorants fluorescents perméables à la membrane et imperméables, et incubez dans l’obscurité.
Le colorant perméable à la membrane traverse des membranes intactes, marquant à la fois les bactéries viables et non viables. En revanche, le colorant imperméable n’entre que dans les membranes endommagées, marquant sélectivement les bactéries non viables.
Après l’incubation, retirez la solution de coloration et lavez-la avec le tampon pour éliminer l’excès de colorant et réduire la fluorescence de fond.
Ajoutez un nouveau milieu et obtenez des images à l’aide de la microscopie confocale.
Les biofilms cultivés avec du filtrat d’expectorations présentent une épaisseur accrue, mettant en lumière le rôle des composants dérivés de l’hôte dans la formation des biofilms.
Après la croissance, retirez le milieu des puits de chambre et lavez doucement chaque chambre deux fois avec 300 microlitres de PBS stérile.
Ensuite, pour préparer le mélange de coloration pour le biofilm, ajoutez 1 microlitre de chaque colorant fourni dans le kit de viabilité à chaque millilitre de solution nécessaire, puis mélangez la solution.
La quantité optimale de colorant et le temps de coloration sont déterminés empiriquement pour chaque organisme.
Ajoutez 200 microlitres du mélange colorant à chaque puits du verre de couverture à chambre. Incubez le verre de couverture.
Après l’incubation, retirez le mélange colorant des chambres et lavez chaque puits avec 300 microlitres de PBS stérile.
Remplacez le PBS par un média frais. Enfin, procédez à la visualisation par microscopie confocale.