Traitement activé par la lumière des biofilms bactériens à l’aide d’un précurseur photosensible

Commençons par des puits de microplaques contenant des biofilms d’une bactérie pathogène, divisés en quatre groupes expérimentaux.

Aspirez doucement le milieu et rincez avec un tampon pour éliminer les cellules non adhérentes.

Ajouter un tampon contenant un précurseur photosensible à deux groupes, tandis que les deux autres reçoivent uniquement le tampon.

Incubez tous les groupes dans l’obscurité pour permettre au précurseur de diffuser à travers le biofilm, d’entrer dans les cellules bactériennes et d’être métabolisé en un photosensibleur qui s’accumule dans le cytoplasme et les membranes.

Après l’incubation, exposez un groupe traité par un précurseur et un groupe tampon uniquement à une irradiation lumineuse.

Dans le groupe traité par les précurseurs, la lumière excite le photosensibilisateur, qui transfère de l’énergie à l’oxygène moléculaire et génère des espèces réactives d’oxygène (ROS).

Les ROS perturbent les membranes, dégradent les protéines et fragmentent l’ADN, entraînant la mort bactérienne des cellules.

Les trois autres conditions ne produisent pas de ROS, car le précurseur ou la lumière sont absents, laissant le biofilm intact.

Pour générer un biofilm dans une plaque à 96 puits, il faut d’abord inoculer un à moins 80 degrés Celsius décongelé Staphylococcus aureus USA trois cents dans trois biofilms, formant des cultures de souches cliniques dans des tubes individuels de 14 millilitres à fond rond contenant cinq millilitres de bouillon de soja tryptone, ou TSB, un milieu, dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec secouage toute la nuit. Lorsque les cultures ont atteint une phase stationnaire, centrifugez les cellules bactériennes et résuspendez les granulés et le PBS à 2 fois 10 à la neuvième colonie, formant ainsi une unité par millilitre. Diluer ces suspensions bactériennes à un ratio de 1 pour 200 et un milieu TSB complété avec 0,5 % de glucose et semer 200 microlitres de cellules bactériennes par puits dans trois puits par souche et groupe expérimental dans une microplaque de 96 puits traitée en culture cellulaire polystyrène pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius, avec de l’oxygène, sans trembler.

Le lendemain, lavez doucement les puits trois fois avec du PBS sans perturber les biofilms. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’ALA fraîchement préparé aux puits expérimentaux appropriés, et placez la plaque à 25 degrés Celsius pendant une heure protégée de la lumière. Ensuite, irradiez la plaque avec une diode électroluminescente à une intensité lumineuse de 100 milliwatts par centimètre carré pendant une heure.