Préparation d’échantillons et imagerie de bactéries marquées par fluorescence

Commencez par une grande lame en verre avec de petites lames placées sur chaque bord, en double couche.

Verser de l’agarose en fusion dans l’espace et recouvrez-la d’une autre grande lame en verre.

Refroidissez le montage pour solidifier l’agarose.

Retirez les lames en verre et découpez l’agarose en petits coussins.

Placez les tampons d’agarose dans un cadre adhésif fixé à une glissière.

Prenez une culture de bactéries pathogènes, génétiquement modifiées pour exprimer un système de sécrétion marqué par fluorescence, essentiel à l’infection de l’hôte.

Utilisez une plaque bactérienne dense et suspendez-la dans l’eau.

Vortex pour disperser les bactéries uniformément.

Appliquez la suspension sur le coussinet d’agarose pour immobiliser les bactéries.

Scellez avec une housse pour maintenir l’hydratation.

Sous éclairage en champ clair, sélectionnez un champ de cellules pour l’imagerie.

Optimisez les réglages du microscope pour réduire le photoblanchiment et augmenter la sensibilité du signal.

Passez au canal de fluorescence pour détecter les bactéries marquées par fluorescence.

Commencez par fabriquer des tampons d’agarose pour l’imagerie des cellules vivantes. Préparez environ 30 millilitres de solution d’agarose à faible fondu à 1 % dans de l’eau et laissez-la passer au micro-ondes dans une fiole en verre pendant environ 90 secondes, en la faisant tourner de temps en temps jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissouse.

Placez deux lames en verre de 22 par 22 par 0,15 millimètre sur le bord d’une lame en verre de 25 par 75 par 1,1 millimètre, l’une sur l’autre. Ensuite, empilez deux autres petites glissières sur l’autre bord. Pipette environ 1 millilitre d’agarose fondue dans la lame centrale entre les deux lames supérieures en verre et placez une autre grande lame sur l’agarose fondue, en veillant à éviter la formation de bulles d’air.

Refroidissez les lames à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes, puis utilisez un scalpel ou une lame de rasoir pour découper doucement le tampon en petits carrés. Fixez un cadre adhésif double face sur une glissière en verre de 25 par 75 par 1,1 millimètre et placez plusieurs tampons sur la glissière. Dissoudre une grosse plaque de Legionella pneumophila dans 1 millilitre d’eau double distillée.

Ensuite, le vortex, et on pipetterait 2 à 3 microlitres de dilution sur les tampons. Placez délicatement un couvercle de 58 par 24 par 0,15 millimètre sur le cadre adhésif. Sélectionnez les cellules pour les imager en utilisant un éclairage de champ lumineux.

Ensuite, dans la fenêtre de capture du logiciel du microscope, ajustez la ND à 180 et le binning à 2 par 2. Utilisez le canal de 488 nanomètres pour exposer l’échantillon pendant 500 à 1000 millisecondes et validez la spécificité de la fluorescence en imageant Legionella pneumophila non marquée avec les mêmes paramètres.