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Commencez par une souris dont le tube digestif est colonisé par Clostridium difficile, un agent bactérien anaérobie formateur de spores.
Maîtrisez la souris et laissez-la déféquer naturellement dans un tube stérile pré-pesé.
Déterminez le poids net de l’échantillon fécal en soustrayant le poids vide du tube du poids total afin de préparer les dilutions appropriées.
Transférez l’échantillon dans un environnement anaérobie pour préserver la viabilité de la bactérie sensible à l’oxygène.
Ajoutez un tampon à l’échantillon et perturbez-le mécaniquement pour libérer son contenu en suspension.
Incubez pour permettre aux débris plus gros de se déposer, retenant ainsi les cellules bactériennes et les spores dans le surnageant.
Effectuer des dilutions en série du surnageant dans le tampon.
Placez les dilutions sur un milieu sélectif et étouffez les en conditions anaérobies.
Le milieu favorise la germination des spores et la croissance sélective de Clostridium difficile tout en inhibant les bactéries concurrentes, ce qui donne lieu à des colonies distinctes.
Comptez les colonies pour quantifier la charge de Clostridium difficile dans les selles et évaluez la colonisation gastro-intestinale.
Pour prélever des échantillons fécaux de souris à des fins d’évaluation, d’abord maintenez légèrement mais fermement la souris concernée par la peau lâche du cou et du dos, afin de s’assurer que l’animal ne soit pas en détresse.
Avec l’auriculaire, soulevez doucement la queue de l’animal, exposant l’anus. Tenez un tube stérile de microcentrifuge de poids connu directement sous l’anus de l’animal, en veillant à ce que le tube ne touche pas directement la souris. Lorsque l’animal défèque, il faut recueillir la granule fécale dans le tube.
Conservez le tube à température ambiante jusqu’à ce que tous les échantillons nécessaires soient collectés. Peser les tubes contenant des excréments sur une balance analytique et noter la masse jusqu’à quatre décimales. Calculez le poids de la pellete fécale en soustrayant le poids du tube.
Ensuite, calculez une dilution de un à dix du contenu et resuspendez en 1x PBS. Utilisez la pointe de la pipette pour détruire doucement les matières fécales en solution. Incubez les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes, laissant le contenu se stabiliser.
En maintenant les solutions de façon anaérobie, effectuez des dilutions en série pour chaque échantillon dans 1x PBS. Transférez 100 microlitres de chaque dilution en série sur des plaques TCCFA. Utilisez un étalant stérile en forme de L et appliquez uniformément le substrat sur les plaques.
Incubez les plaques en conditions anaérobies à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Enfin, énumérez les colonies de C. difficile et calculez l’unité formatrice de colonies par gramme de contenu fécal.