Essai à base de fluorescence pour étudier les interactions des récepteurs des macrophages avec les antigènes bactériens

Commencez par le M marqué par fluorophore rouge. antigènes tuberculeux immobilisés sur une couche de couverture recouverte de polymère.

Ajoutez un tampon de blocage pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Lavez-le pour éliminer l’excès de bloqueur.

Introduire une protéine totale extraite des macrophages humains, incluant le récepteur de surface cellulaire d’intérêt. Incubez.

Les récepteurs des macrophages se lient aux antigènes bactériens immobilisés.

Ajouter un réticulateur pour stabiliser les complexes récepteur–antigène, suivi d’un quencher pour neutraliser les réticulateurs non réagis.

Lavez et ajoutez un second réticulateur pour renforcer les complexes.

Lave-toi encore. Ensuite, retirez la couche de couverture et inversez-la sur une solution primaire d’anticorps.

Les anticorps se lient au récepteur macrophage d’intérêt.

Lavez et inversez le vernis sur une solution secondaire d’anticorps conjuguée au fluorophore vert, qui se lie aux anticorps primaires.

Laver et fixer la toile de protection.

Visualisez l’échantillon sous un microscope à fluorescence. Les signaux rouges et verts co-localisés confirment l’interaction entre le récepteur des macrophages et l’antigène bactérien.

À l’aide d’une pince chirurgicale à bec rond, placez des couvercles ronds de 12 millimètres dans les puits d’une plaque de culture à 24 puits.

Incubez la couche de couverture avec des antigènes rhodaminiques de Mycobacterium tuberculosis pendant 1 heure à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajoutez 100 microlitres d’extrait protéique dilué dans 300 microlitres de PBS et étouffez pendant 2 heures à température ambiante avec agitation. Enveloppez le couvercle de la plaque de culture avec un film de paraffine.

Ajoutez une goutte de 60 microlitres d’anticorps primaire anti-SLAMF1 précédemment titré sur le couvercle recouvert de film de paraffine. Retirez soigneusement la glisse de la plaque à l’aide d’une pince chirurgicale courbe à pointe fine et des aiguilles. Après incubation avec une solution primaire et secondaire d’anticorps, retirez l’excès de liquide et montez la gaine de couvercle sur une goutte de liquide de montage placée sur une lame en verre. Placez la lame sous un microscope à fluorescence et observez les cellules à l’aide de filtres appropriés.