Imagerie à haut débit de l’infection intracellulaire par Brucella abortus dans les cellules épithéliales de l’hôte
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 3:43 min • March 31st, 2026
Commençons par les cellules épithéliales dans lesquelles l’expression de la protéine adaptatrice de l’interféron, un médiateur clé de l’immunité innée, a été réduite, rendant les cellules plus sensibles à l’infection par Brucella .
Remplacer le milieu par un milieu infectieux contenant Brucella abortus (protéine fluorescente verte) exprimant Brucella abortus, un pathogène intracellulaire facultatif, à la concentration désirée.
Centrifugez la plaque pour favoriser le contact entre les bactéries et les cellules hôtes, puis incubez pour permettre l’internalisation bactérienne.
Lavez les cellules avec un substrat contenant du sérum et traitez-les avec un antibiotique pour éliminer les bactéries extracellulaires.
Incubez davantage pour permettre à Brucella de se multiplier intracellulairement.
Laver les cellules avec un tampon et les fixer avec du paraformoldéhyde pour préserver les structures intracellulaires.
Rincez l’excès de fixateur. Ensuite, ajoutez un tampon complété de détergent pour perméabiliser les cellules.
Rincez la lessive résiduelle, puis ajoutez du DAPI pour tacher les noyaux, et effectuez un lavage final.
À l’aide d’un microscope automatisé, acquérez des images à haut débit de l’infection à Brucella dans les cellules épithéliales de l’hôte.
À l’aide d’un lave-plaques automatisée, échangez le milieu de transfection par 50 microlitres de milieu d’infection. À l’intérieur du capot, transférez la plaque dans la cage de centrifugeuse et centrifugez la plaque de 384 puits à 400 fois g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Ensuite, utilisez du parafilm pour sceller la plaque et incubez-la sur une plaque en aluminium préchauffée à 37 degrés Celsius et 5 % deCO2 pendant quatre heures. Après l’incubation avec le lave-plaques automatisé, utilisez du DMEM avec un FCS à 10 % contenant 100 microgrammes par millilitre de Gentamicine ou GM pour laver les cellules et inactiver les bactéries extracellulaires. Ensuite, utilisez du parafilm pour sceller la plaque et replacez-la sur la plaque en aluminium préchauffée dans l’incubateur pendant encore 40 heures pour l’analyse finale.
Pour réparer les cellules, utilisez d’abord du PBS pour laver les puits. Ensuite, échangez le PBS avec 50 microlitres de PFA à 3,7 % dans un HEPES 0,2 molaire à pH 7,4 et incubez les cellules à température ambiante pendant 20 minutes.
Après l’incubation, utilisez 50 microlitres de PBS pour échanger le milieu de fixation. Pour colorer les échantillons avec le lave-plaques automatisé, commencez par utiliser 50 microlitres de Triton X-100 à 0,1 % dans des PBS pendant 10 minutes pour perméabiliser les cellules.
Après avoir utilisé le PBS pour laver les cellules trois fois, ajoutez 50 microlitres de PBS avec un microgramme par millilitre de DAPI et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, utilisez le PBS pour laver les cellules trois fois avant de les protéger de la lumière. Transférez la plaque au microscope automatisé.
Aperçu
Ce protocole décrit une méthode d'imagerie à haut débit de l'infection intracellulaire par Brucella abortus dans les cellules épithéliales hôtes. Il permet aux chercheurs de visualiser et d'analyser le processus infectieux, contribuant ainsi à une meilleure compréhension de la pathogenèse de Brucella.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Interactions agent pathogène-hôte
- Biologie cellulaire
Contexte
- Brucella abortus est un agent pathogène intracellulaire facultatif.
- Comprendre son mécanisme d'infection est essentiel pour développer des stratégies thérapeutiques.
- L'imagerie à haut débit peut faciliter des études à grande échelle des dynamiques d'infection.
- La susceptibilité des cellules hôtes peut être modulée en réduisant les facteurs de l'immunité innée.
Objectif de l'étude
- Visualiser le processus d'infection intracellulaire de Brucella abortus.
- Évaluer l'impact des facteurs cellulaires de l'hôte sur la susceptibilité à l'infection.
- Fournir une méthode fiable pour l'étude de la pathogénie bactérienne.
Méthodes utilisées
- Infection de cellules épithéliales par Brucella abortus exprimant la GFP.
- Utilisation d'antibiotiques pour éliminer les bactéries extracellulaires.
- Imagerie à haut débit par microscopie automatisée.
- Fixation cellulaire et coloration pour la visualisation des noyaux.
Résultats principaux
- Ce protocole décrit les étapes de préparation et d'imagerie de cellules infectées.
- Il présente l'utilisation de réactifs et de conditions spécifiques pour des résultats optimaux.
- L'imagerie à haut débit permet l'analyse simultanée de plusieurs échantillons.
- Les résultats peuvent fournir des informations sur le comportement intracellulaire de Brucella abortus.
Conclusions
- La méthode permet une observation détaillée de l'infection par Brucella dans les cellules hôtes.
- Elle peut être utilisée pour étudier les effets de divers traitements sur la dynamique de l'infection.
- Cette approche pourrait contribuer au développement de nouvelles interventions thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole d'imagerie à haut débit permet une interrogation systématique des interactions hôte-pathogène dans des modèles d'infection bactérienne intracellulaire. En quantifiant la réplication de Brucella abortus dans des cellules épithéliales soumises à des perturbations génétiques définies, il soutient la validation de cibles et la réduction des risques mécanistiques dans les programmes de découverte d'agents antimicrobiens. Le format du test offre une confiance prédictive pour la priorisation des thérapeutiques dirigées contre l'hôte et des efforts d'identification de composés leaders axés sur les voies biologiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en reliant les voies de détection de l'ADN cytosolique aux phénotypes de réplication bactérienne intracellulaire.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles grâce à l'extinction médiée par ARNsi de médiateurs de l'immunité innée tels que STING.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en quantifiant la dynamique de l'infection sous modulation contrôlée des facteurs de l'hôte.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes de cellules épithéliales validés pour des campagnes de criblage de composés ou génétiques en aval.
- Valeur opérationnelle : Standardise les lectures d'infection par microscopie automatisée et le suivi quantitatif de pathogènes exprimant la GFP.
- Valeur en termes de scalabilité : Facilite la réutilisation de la plateforme dans des formats 384-puits pour le criblage à haut contenu de facteurs cellulaires hôtes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Préserve la pertinence pathologique en modélisant l'infection épithéliale par Brucella, une étape clé de la pathogénie zoonotique.
- Continuité préclinique : Relie les mécanismes découverts en phase initiale à leur validation dans des contextes cellulaires hôtes physiologiquement pertinents.
- Décisions adaptées au risque : Guide les critères de progression en révélant les dépendances de l'hôte essentielles à la survie intracellulaire.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur la cible à l'identification de composés actifs, jusqu'à la validation préclinique du mécanisme, en particulier pour les programmes ciblant les pathogènes intracellulaires.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses concernant les facteurs de l'hôte influençant l'internalisation et la réplication des agents pathogènes.
- Triage : Assure la préparation des tests grâce à des protocoles standardisés d'infection, de sélection antibiotique et de fixation.
- Analyse : Fournit des mesures quantitatives de la charge intracellulaire en agents pathogènes par détection du signal GFP et double coloration nucléaire pour une analyse au niveau cellulaire unique.
- Recherche translationnelle : Corrèle la modulation des voies immunitaires innées aux résultats de l'infection, facilitant la validation des mécanismes alignés sur des biomarqueurs.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme d'imagerie réutilisable, applicable à d'autres bactéries ou virus intracellulaires porteurs de marqueurs fluorescents.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans l'interaction hôte-pathogène en isolant les contributions spécifiques de l'immunité innée.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à une manipulation automatisée des liquides, à une incubation standardisée et à une imagerie à point final fixe.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en fournissant précocement des phénotypes quantitatifs d'infection lors de la validation de cibles.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des anti-infectieux ciblant l'hôte, sur la base de données de dépendance génétique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire, transfection et manipulation de pathogènes intracellulaires en conditions BSL-2.
- Dépend d'une infrastructure de microscopie automatisée capable d'acquérir les signaux GFP et DAPI en format 384-puits.
- Exige une standardisation inter-équipes du moment d'infection, de la sélection aux antibiotiques et des protocoles de fixation.
- L'adaptation à des modèles primaires ou épithéliaux différenciés peut nécessiter une optimisation de l'efficacité d'infection et des contrôles de toxicité.
- Les limites pratiques incluent la dépendance à des souches pathogènes fluorescentes et une variabilité potentielle de l'efficacité de transfection entre les puits.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026