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Commencez par des échantillons bactériens prétraités avec des concentrations croissantes d’un antibiotique qui élimine les bactéries sensibles.
Ajoutez un milieu de croissance contenant de l’oxyde de deutérium et la même concentration d’antibiotiques aux tubes correspondants.
Incubez les tubes sous des conditions de secouement.
L’oxyde de deutérium pénètre dans les cellules bactériennes, où le deutérium est incorporé dans les biomolécules nouvellement synthétisées, formant des liaisons carbone–deutérium.
Broyez les bactéries, jetez le surnageant et lavez.
Ajoutez un fixateur pour préserver la structure bactérienne.
Ajoutez de l’eau, centrifugeuse, et retirez le surnageant.
Résuspendez la bactérie et transférez la suspension sur un verre de couverture recouvert de poly-L-lysine, puis scellez-le.
Placez l’échantillon sur la scène d’un microscope Raman stimulé ou SRS précalibré. Ajoutez de l’eau et baissez l’objectif.
Acquérir des images de plusieurs champs pour évaluer la fréquence vibratoire carbone-deutérium.
À des concentrations plus élevées d’antibiotiques, le signal carbone-deutérium diminue, indiquant une viabilité bactérienne réduite.
Cela permet une évaluation rapide de la susceptibilité aux antibiotiques en corrélant l’intensité du signal SRS avec la viabilité bactérienne.
Après une heure d’incubation, ajoutez 700 microlitres d’antibiotiques dilués en série avec un milieu MHB contenant 100 % de deutérium à 300 microlitres de bactéries prétraitées à la même concentration. Homogénéisez le mélange en pipettant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Ajoutez 700 microlitres de milieu MHB sans antibiotiques contenant 100 % à 300 microlitres de bactéries sans antibiotiques en contrôle positif.
Ajouter 700 microlitres de deutérium contenant 0 % sans antibiotiques à 300 microlitres de bactéries sans antibiotiques en témoins négatif. Incubez tous les microtubes à 37 degrés Celsius et 200 rotations par minute pendant 30 minutes. Après l’incubation, centrifugez l’échantillon de 1 millilitre d’antibiotique et de bactéries traitées au deutérium à 6 200 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, lavez les granulés deux fois avec de l’eau purifiée. Fixez les échantillons dans une solution de formol de 10 % volume, et conservez-les à 4 degrés Celsius.
Pour la préparation de l’échantillon, lavez 1 millilitre de solution bactérienne fixée avec de l’eau purifiée, puis centrifugez la solution lavée à 6 200 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius.
Retirez le surnageant et enrichissez la solution bactérienne à environ 20 microlitres avec de l’eau stérilisée. Déposez la solution bactérienne sur un verre de couverture recouvert de poly-L-lysine, ajoutez un autre verre de recouvrement, puis scellez l’échantillon. Placez l’échantillon bactérien sur l’étape d’extraction sous l’objectif d’immersion 60x. Commencez l’imagerie SRS des échantillons bactériens. Imagez au moins trois champs de vision pour chaque échantillon.