Modèle intestinal in vitro pour évaluer l’adhésion et l’internalisation bactériennes

Commencez par un insert Transwell contenant une co-culture de cellules épithéliales et de cellules ressemblant à un gobelet.

Les cellules épithéliales forment des jonctions serrées, tandis que les cellules en forme de gobelet produisent du mucus, reproduisant la barrière épithéliale intestinale in vivo.

Prenez une suspension de la communauté bactérienne buccale qui a été traitée avec un liquide intestinal simulé pour imiter la digestion de l’intestin grêle.

Remplacez le média dans la chambre supérieure par la suspension bactérienne.

Incubez avec des secousses pour faciliter l’adhésion et l’internalisation bactériennes.

Collectez le milieu de la chambre supérieure contenant des bactéries non adhérentes pour des tests de viabilité ultérieurs.

Ajoutez une solution dissolvante de mucus et incubez pour solubiliser le mucus et libérer les bactéries adhérées.

Collectez la solution pour une analyse approfondie de la viabilité et de l’adhérence bactériennes.

Lavez les cellules avec du tampon et ajoutez un détergent pour les déloger.

Récupérez la suspension de la cellule.

Faites un vortex sur la suspension pour lyser les cellules et libérer les bactéries intériorisées.

Centrifugez et collectez séparément les débris surnageants et cellulaires pour une analyse plus approfondie.

Après avoir lavé et ajusté la densité cellulaire de la digestion de l’intestin grêle selon le protocole textuel, retirez le milieu apical du système transwell et ajoutez 1,5 millilitre de suspension bactérienne.

Co-culture du système en conditions générales de culture cellulaire pendant 2 heures. Ajoutez 0,5 millilitre de 10 millimolaires n-acétylcystéine dans le HBSS pour solubiliser le mucus produit par le HT29-MTX et récupérer les bactéries adhérées.

Incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 1 heure sous agitation. Récupérez le NAC-HBSS dans un tube de microcentrifuge, et utilisez 1 millilitre de DPBS pour laver les cellules deux fois. Ajoutez 0,5 millilitres de triton X-100 à 0,5 % au-dessus des monocouches, et perturbez les cellules en pipetant.

Ensuite, récupérez rapidement le liquide dans le vortex pendant 1 minute. La rapidité est cruciale pour éviter d’endommager les cellules bactériennes avec le détergent. Analysez les échantillons selon le protocole textuel.