Name: Dissection de lhomme des éléments du corps vitré de lanalyse protéomique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-23T17:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Découvrez la dissection du corps vitré humain pour l'analyse protéomique. Cette méthode isole l'hyaloïde antérieure, la base vitrée et le cortex avec précision. Elle prépare des échantillons de qualité pour les études oculaires.

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Le financement a été fourni par Fight for Sight. Les tissus ont été obtenus auprès de la Banque Oculaire des Lions de l&#39;Iowa.

1. Dissection du segment antérieur. <ol><li> La cornée est enlevée en faisant d'abord une incision au niveau du limbe dans la chambre antérieure à l'aide d'une lame de 15 ° (figure 1). Puis une lame incurvée de la cornée-sclérale ciseaux est inséré dans la chambre antérieure. Découpes circonférentielles sont faites dans la cornée, juste en avant du limbe. </li><li> 0,12 Colibri pinces et de ciseaux Westcott sont utilisés pour couper l'iris circonférentiellement antérieure du corps ciliaire. </li><li> Le noyau du cristallin est retiré avec une pince ou d'un Colibri 0,12 à 15 ° lame (supersharp) et le cortex et la capsule avec une pince. </li></ol> 2. Aspiration fondamentale vitré. <ol><li> Une aiguille de calibre 23 sur une seringue de 5 cc est inséré dans le milieu du vitré (figure 1). </li><li> Environ 1 mL ou plus du noyau du vitré est doucement aspiré. </li><li> L'échantillon est ensuite placé dans un tube de centrifugeuse, puis dans l'azote liquide. </li></ol> 3. Dissection antérieure hyaloïde. <ol><li> La hyaloïde antérieure est considéré comme un anneau semi-transparente en ajustant la lumière incidente à partir d'un microscope à lumière col de cygne. L'aspiration précédente du noyau vitreux sépare la hyaloïde antérieure auprès d'autres structures pour faciliter leur identification. </li><li> La feuille de tissu élastique est soigneusement arrachée du corps ciliaire avec Colibri ou pinces à pansement et coupé avec des ciseaux Vannas. Cette manoeuvre est répétée. </li><li> L'échantillon est ensuite placé dans un tube de centrifugeuse, puis dans l'azote liquide. </li></ol> 4. Dissection base du vitré. <ol><li> Utiliser 0,12 pince pour stabiliser la coupe des yeux, des ciseaux Westcott sont utilisés pour «fleur» de l'œil en faisant quatre équidistants-stress coupes du corps ciliaire vers la tête du nerf optique. </li><li> Le plicata pars du corps ciliaire (figure 2) est retiré de chacun des quadrants en utilisant des ciseaux Westcott. </li><li> La base du vitré est ensuite saisie de chaque côté de l'ora serrata avec une pince sur la pars plana et de la rétine (figure 2). </li><li> Traction continue sur la base du vitré est appliqué avec la pince. De coupe avec des ciseaux séquentielle Westcott extraits un tissu semi-transparent avec un «collier de perles" apparence car elle est excisée. </li><li> L'échantillon est ensuite placé dans un tube de centrifugeuse, puis dans l'azote liquide. </li></ol> 5. Retrait cortex vitréen. <ol><li> La pars plana est excisé de chacun des quadrants avec des ciseaux Westcott en coupant la notice d'environ 3 mm en arrière de l'ora serrata (figure 2). </li><li> Entre les feuillets de tissu, le cortex vitréen est visualisée comme un film semi-transparents. </li><li> Le film élastique est soit saisi avec une pince 0,12 ou détenus par l'adhésion à une éponge Weck-Cel chirurgicale. Le cortex vitréen est alors arrachée de la rétine et excisée avec des ciseaux Westcott (figure 1). </li><li> L'échantillon est placé dans un tube de centrifugeuse, puis dans l'azote liquide. Tous les échantillons sont stockés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation pour l'expérimentation. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Des échantillons de tissus peuvent être traités par une variété de méthodes pour des expériences spécifiques. Dans notre cas, les échantillons ont été soumis à l'analyse des protéines par SDS-PAGE (figure 3). <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Vue en coupe de l'œil humain dépeignant sous-structures différentes parties du corps vitré. Le vitré plus antérieure est une fine couche de collagène appelé la hyaloïde antérieure. Le noyau vitreux comprend toute la région centrale du corps vitré. Cette portion du corps vitré est plus aqueuse, contrairement à la base du vitré, ce qui est assez visqueux pour être saisi par des pinces et est fermement attaché au corps ciliaire et la rétine sous-jacente. Englobant le cœur vitré est une coquille très mince collagène appelé le cortex vitréen. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Anatomie base du vitré. La base du vitré est une sous-structure semi-transparente du corps vitré situé le long de l'ora serrata (flèches blanches), qui est la ligne de démarcation séparant le corps ciliaire et la rétine. Le bord antérieur de la base du vitré s'étend sur la pars plana (ligne blanche) du corps ciliaire. Le bord postérieur de la base du vitré s'étend 2-3-mm derrière l'ora serrata (tiret blanc). Pour accise la base du vitré, forceps sont utilisés pour saisir le tissu et tirez loin du corps ciliaire et la rétine sous-jacente. Une fois élevés, ciseaux Westcott sont utilisés pour couper le long de la base. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Unidimensionnelle SDS-PAGE des éléments du corps vitré. Concentrations de protéines totales de la hyaloïde antérieure, base du vitré, vitreous coeur, et cortex vitréen étaient 11,24, 20,1, 16,61, 14,24 mg / mL, respectivement. L'électrophorèse sur gel a été réalisée à 200 kV pendant 45 minutes, colorées avec Flamingo (Bio-Rad), et visualisées en utilisant un système d'imagerie VersaDoc (Bio-Rad). Les profils pour les différents tissus montrent plusieurs bandes similaires, indiquant soit conservée ou la contamination croisée des protéines, ainsi que des bandes uniques (astérisque), indiquant protéines différentiellement localisées.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Ophthalmol+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+inflammatory+immune+mediators+in+vitreoretinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases.</a> PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Azimzadeh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li>
</ol>

Le corps vitré est un gel semi-transparente, dont la composition moléculaire est mal comprise, en particulier au niveau de ses sous-structures: la base du vitré, le noyau, le cortex, et hyaloïde antérieure. Le noyau contient du vitré collagènes II, V, IX et XI, avec les protéoglycanes chondroïtine sulfate, héparane sulfate protéoglycanes, et hyaluronane 1,2. Biomarqueurs protéiques dans le coeur du vitré ont été associés à des maladies telles que la rétinopathie diabétique. 3-5 Comment ces protéines sont différentiellement exprimés dans chacune des sous-structures, et dans de nombreux cas l&#39;identité des protéines spécifiques, ne sont pas connus. Ces détails peuvent donner un aperçu de l&#39;origine des protéines associées à certaines maladies vitréo-rétinienne et d&#39;aider les thérapies futures cibles. Bien que le poste d&#39;intervalle optimal mortem pour la dissection des tissus n&#39;a pas été déterminée, la dégradation des protéines peut affecter expériences en aval. Par exemple, l&#39;immunohistochimie est affectée dans les yeux de l&#39;autopsie de 12 heures et certaines activités enzymatiques spécifiques peuvent être réduits en quelques heures (observation non publiée). Tous les tissus dans cette étude ont été recueillies entre 2 et 8 heures de la mort, sans changements importants dans l&#39;expression de protéines ou d&#39;aptitude à analsyis protéomique. La méthode de congélation de l&#39;azote liquide de conservation est choisi au cours de fixation afin d&#39;éviter de petits changements dans la structure des protéines causée par fixateur réticulation, ce qui a été démontré dans d&#39;autres tissus par LC-MS/MS. 6 études protéomiques dépendra de la capacité à bien disséquer les différents compartiments du corps vitré, comme l&#39;a démontré dans cette expérience vidéo. Nous avons validé la technique de dissection avec une dimension SDS-PAGE. Comme nos résultats suggèrent, il ya des protéines différentiellement exprimés dans les sous-structures différentes du corps vitré. L&#39;identification de ces protéines permettra une compréhension plus détaillée de cloisonnement vitré.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td></tr><tr><td> 0,12 pince </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1502 </td></tr><tr><td> 5 cc seringue </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Droit pinces à pansement avec des dentelures </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1400 </td></tr><tr><td> Aiguille de calibre 23 </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 305145 </td></tr><tr><td> Colibri pince </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td></tr><tr><td> Castroviejo angle des ciseaux cornéens </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3223 </td></tr><tr><td> Vannas courbé ciseaux à capsulotomie </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3387 </td></tr><tr><td> Weck-Cel chirurgicale lances </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td></tr><tr><td> Ciseaux Westcott ténotomie courbé </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3320 </td></tr></tbody></table>

dissection de l&#39;homme des éléments du corps vitré de l&#39;analyse protéomique

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

Le vitré est une optiquement clair, matrice de collagène extracellulaire qui remplit l&#39;intérieur de l&#39;œil et recouvre la rétine. 1,2 interactions anormales entre les sous-structures vitré et la rétine sous-tendent plusieurs maladies vitréo-rétinienne, y compris la déchirure de la rétine et le détachement, plissement maculaire, trou maculaire, liée à l&#39;âge de traction vitréo dégénérescence maculaire, vitréorétinopathie proliférante, rétinopathie diabétique proliférative, et vitreoretinopathies hérité. 1,2 La composition moléculaire des sous-structures vitreuses n&#39;est pas connue. Puisque le corps vitré est transparent avec accès chirurgical limité, il a été difficile à étudier ses sous-structures au niveau moléculaire. Nous avons développé une méthode permettant de séparer et de préserver ces tissus pour l&#39;analyse protéomique et biochimique. La technique de dissection dans cette vidéo expérimentale montre comment isoler base du vitré, hyaloïde antérieure, le noyau vitreux, et le cortex vitré de l&#39;autopsie yeux humains. Unidimensionnelle SDS-PAGE des analyses de chaque composant du vitré a montré que notre technique de dissection donné lieu à quatre profils protéiques unique correspondant à chaque sous-structure du vitré humain. Identification de protéines différentiellement compartimentée révélera molécules candidates qui sous-tendent diverses maladies vitréo-rétinienne.

Cette vidéo montre une technique efficace pour différencier et disséquer les différentes structures de semi-transparente du corps humain vitreuse en post mortem yeux.

Dissection de l&#39;homme des éléments du corps vitré de l&#39;analyse protéomique

Le corps vitré est une matrice extracellulaire collagénique, optiquement transparente, qui remplit l'intérieur de l'œil et recouvre la rétine. 1,2 Des interactions anormales...

Le vitré est une matrice extracellulaire optiquement transparente qui remplit l'intérieur de l'œil. Il peut être divisé en plusieurs sous-structures, notamment l'hyaloïde antérieure située derrière le cristallin, la base du vitré au niveau de la rétine antérieure, le cortex vitréen formant une enveloppe élastique et le noyau vitréen situé au centre. Pour disséquer le vitré, nous devons d'abord retirer le segment antérieur.Une lame très tranchante est utilisée pour inciser la cornée au niveau du limbe. Ensuite, des ciseaux cornéo-scléraux servent à couper la cornée juste en avant du limbe. L’iris est disséqué à l’aide de ciseaux courbes en le tirant depuis sa face.Une pression douce sur le globe oculaire peut expulser le noyau. Pour retirer le noyau vitréen, utilisez une aiguille de calibre 23 sur une seringue de 5 cm³ et aspirez le vitré, principalement liquide. L'hyaloïde antérieur devient visible sous la forme d'une fine structure membraneuse transparente qui peut être saisie à l'aide d'une pince. Il s'agit d'une structure élastique située juste derrière le cristallin. Le cercle intérieur est le ligament de Wieger. Des ciseaux de Van sont utilisés pour couper l'hyaloïde tandis que des pinces exercent une traction.Le tissu latéral peut être transféré dans un tube afu et la manœuvre est répétée jusqu'à ce que tout le tissu ait été disséqué. Pour accéder aux sous-structures vitréennes restantes, il est nécessaire d'ouvrir l'œil à l'aide de ciseaux courbes de Westcott. Chaque lamelle est écartée à l’aide de forceps dans une boîte de Pétri.Cette image montre l'anatomie de la base du vitré, un tissu mince et transparent qui chevauche laora serrata. Laora serrata constitue la ligne de démarcation entre le corps ciliaire en avant et la rétine en arrière. Contrairement aux autres parties du vitré, la base du vitré adhère fermement au corps ciliaire et à la rétine sous-jacents ; ainsi, une traction avec une pince soulève effectivement le tissu.Pour isoler la base du vitré, nous retirons d'abord la pars plana à l'aide d'une pince et de ciseaux de Wescott. La pars plana est cette petite zone présentant des crêtes. Ensuite, pour isoler la base du vitré, couper deux à trois millimètres en arrière de l'aura avec les ciseaux de Wescott tout en stabilisant l'œil à l'aide de la pince, maintenir et exercer une traction sur la base du vitré à l'aide de la pince, puis effectuer des coupes successives avec les ciseaux de Wescott.On observe un aspect en collier de perles lorsque la base du vitré est excisée, et l'on peut voir comment cette matrice extracellulaire pourrait compartimenter les protéines. Différentes techniques peuvent être utilisées pour disséquer l'enveloppe du vitré. Le contact avec une éponge de cellules WEX soulèvera le cortex.Un bord du cortex peut être trouvé entre les feuillets, comme indiqué ici. Utilisez à nouveau la pince pour créer une traction et prenez les ciseaux de VanNess afin de couper séquentiellement le cortex vitréen. Le cortex peut également être soulevé à partir du disque, et des ciseaux de Westcott plus grands sont alors utilisés pour disséquer le cortex tandis qu'il est soigneusement détaché de la surface de la rétine.Les échantillons peuvent ensuite être placés dans un micro et conservés pour une analyse protéomique ultérieure.

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