Purification of Bacteriophages Using a Sucrose Density Gradient
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 3:36 min • July 1st, 2026
Begin with a suspension containing bacteriophages and host bacterial debris.
To purify the bacteriophages, sequentially add high-density and low-density sucrose solutions into an ultracentrifuge tube.
Using a gradient-forming instrument, mix the sucrose solutions by tilt-tube rotation to create a continuous density gradient.
Remove a small volume of sucrose gradient from the top, then carefully add the bacteriophage-debris mixture without disturbing the gradient.
Ultracentrifuge to facilitate differential migration of bacteriophages and bacterial debris based on their densities.
The bacteriophages localize as a thick, milky band halfway down the gradient.
Using a blunt cannula-assembled syringe, aspirate the phage band and transfer it to an ultracentrifuge tube.
Add buffer and mix gently.
Ultracentrifuge again to pellet the bacteriophages. Discard the supernatant.
Add buffer and incubate under cold conditions to allow resuspension of bacteriophages.
The purified bacteriophages are ready for further studies.
Prepare four 5 to 45 % sucrose gradients by pipetting 2.5 milliliters of 45 % sucrose into four ultracentrifuge tubes. Top the layer with approximately 2.6 milliliters of 5 % sucrose, stopping when the liquid reaches 2 millimeters from the rim of the tube.
Mix the gradients by tilt tube rotation using a gradient forming instrument for 43 seconds at 86 degrees and 23 RPM. Using a 1 milliliter pipette, add 500 microliters of the pooled phage suspension by bringing the tip into contact with the liquid surface and very slowly dispensing the volume onto the top of the sucrose gradient, being careful to not mix through rapid pipetting. Centrifuge at 70,000 times g for 20 minutes at 4 degrees Celsius.
Submerge a blunt cannula into the solution until the tip is centered on the very upper edge of the phage band. Remove the band by drawing on the syringe plunger until the majority of the phage band has been removed. Then add the sucrose volume with the suspended phage to three or four ultracentrifuge tubes.
Fill the tubes to between 3 and 4 millimeters from the top of the tube with cold 1x TM. Cover the tubes with paraffin film and invert to mix. Place the tubes back in an ultracentrifuge and spin at 145,000 times g for 1 hour at 4 degrees Celsius.
Quickly pour off the supernatant and drain upside down on disposable wipes. Divide 200 to 400 microliters of cold 1x TM across all pellets and resuspend overnight at four degrees Celsius. No shaking is required.
Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant de purifier des bactériophages à partir d'un mélange contenant des débris bactériens hôtes, en utilisant un gradient de densité de saccharose et une ultracentrifugation. La méthode permet une séparation efficace et une récupération de phages infectieux pour des applications en aval.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des bactériophages
- Techniques de biologie moléculaire
- Virologie
Contexte
- Les préparations de bactériophages contiennent souvent des débris bactériens après leur propagation dans des cellules hôtes.
- La purification est essentielle pour une analyse et des applications en aval précises.
- La centrifugation en gradient de densité de saccharose sépare les particules selon leur densité flottante.
- Cette méthode permet l'isolement de particules de phage intactes et infectieuses.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour la purification de bactériophages à partir des débris bactériens.
- Montrer l'utilisation de gradients de densité de saccharose pour une séparation efficace des phages.
- Permettre la récupération de particules phagiques hautement purifiées et infectieuses pour des études ultérieures.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un gradient continu de densité de saccharose (5 % à 45 %) dans des tubes d'ultracentrifugation.
- Dépôt soigneux du mélange de bactériophages et de débris bactériens sur le gradient.
- Ultracentrifugation à 70 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C pour séparer les bactériophages des débris.
- Aspiration de la bande visible de bactériophages à l'aide d'une canule contondante et d'une seringue.
- Échange de tampon et nouvelle ultracentrifugation à 145 000 × g pendant 1 heure à 4 °C afin d'obtenir un culot de bactériophages.
- Resuspension des culots de bactériophages purifiés dans un tampon froid pendant toute la nuit.
Résultats principaux
- Les phages forment une bande distincte et laiteuse dans le gradient de saccharose, permettant leur identification visuelle et leur extraction.
- Le protocole sépare efficacement les phages des débris bactériens.
- Les phages récupérés sont adaptés à des analyses et expériences ultérieures.
- La méthode fournit des préparations de bactériophages hautement purifiées et infectieuses.
Conclusions
- La centrifugation en gradient de densité de saccharose est une technique fiable pour purifier les bactériophages.
- Le protocole permet d'obtenir des préparations de phages de haute qualité, débarrassées de la plupart des contaminants.
- Cette méthode facilite les études virologiques et moléculaires en aval nécessitant des échantillons de phages purs.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
La purification fiable des bactériophages est essentielle pour obtenir des stocks viraux de haute qualité utilisés dans les phases précoces de découverte, le développement de tests et les études mécanistiques. L'ultracentrifugation en gradient de densité de saccharose permet d'éliminer les contaminants d'origine bactérienne, facilitant ainsi des analyses en aval reproductibles et des flux de travail R&D pluridisciplinaires. Cette capacité renforce la fiabilité prédictive des criblages basés sur la virologie et des programmes de recherche translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'isolement de phages intacts et infectieux pour l'analyse mécanistique des interactions hôte-pathogène.
- Réduit les débris cellulaires de l'hôte qui peuvent biaiser les résultats, facilitant ainsi la validation fonctionnelle de l'activité des phages.
- Facilite l'utilisation de matériel d'entrée reproductible pour des études fondées sur des hypothèses et la réduction des risques associés aux cibles.
Développement de criblages et de tests
- Permet d'obtenir des préparations de phages standardisées et exemptes de contaminants pour des dosages quantitatifs de l'infectiosité.
- Assure la reproductibilité et la comparabilité des dosages entre différentes séries expérimentales.
- Permet la production à grande échelle de stocks de phages destinés à des plateformes de criblage haut-débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Fournit des phages purifiés adaptés au développement de modèles précliniques et aux études translationnelles de biomarqueurs.
- Garantit la continuité de la qualité du matériel depuis la découverte jusqu'à la validation préclinique.
- Réduit la variabilité biologique, soutenant ainsi les décisions d'avancement ajustées au risque.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode de purification se situe à l'interface entre la découverte précoce et le développement de tests, fournissant des stocks viraux de haute qualité pour des flux de travail mécanistiques, de criblage et translationnels en aval.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en fournissant des préparations de phages pures pour des études mécanistiques.
- Criblage : Permet des tests d'infectiosité reproductibles et quantitatifs en éliminant les contaminants de l'hôte.
- Analytique : Facilite la mesure précise de la concentration et de l'activité des phages pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Fournit un matériau d'entrée uniforme pour des études précliniques et des analyses d'alignement de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Met en place un protocole de purification standardisé, adaptable à divers systèmes de phages et d'hôtes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études basées sur les phages.
- Valeur opérationnelle : Assure une purification standardisée, reproductible et évolutible des phages.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions d'orientation (go/no-go) et l'efficacité du capital en minimisant le bruit biologique.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement ajustés au risque des actifs liés aux phages.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en ultracentrifugation et en préparation de gradients.
- Exige un accès à des centrifugeuses à grande vitesse et à des instruments de formation de gradients.
- Implique une standardisation inter-équipes des protocoles de gradient et de manipulation.
- Adaptable à divers systèmes phage-hôte moyennant l'optimisation des paramètres du gradient.
- Limité par le débit et la scalabilité inhérents aux méthodes basées sur l'ultracentrifugation.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Une technique d'enrichissement Optimisé pour l'isolement de
Vidéos connexes
0 Vues
Construction du bactériophage synthétique affiche Fab bibliothèque avec diversité sur mesure
Vidéos connexes
0 Vues
Élimination des bactériophages dans des cultures de salmonelles infectées
Vidéos connexes
0 Vues
Après Cell-sort
Vidéos connexes
0 Vues
Séparation des fractions membranaires internes et externes des bactéries à Gram négatif
Vidéos connexes
0 Vues
Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages
Vidéos connexes
0 Vues
Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells
Vidéos connexes
0 Vues
Phage Purification from Borrelia burgdorferi
Vidéos connexes
0 Vues
Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate
Vidéos connexes
0 Vues
Purification de sous-populations de vésicules extracellulaires : une technique pour purifier des sous-populations de vésicules extracellulaires à l’aide de l’ultracentrifugation à gradient de densité
Vidéos connexes
0 Vues
Dernière mise à jour : 22 août 2026