Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 3:40 min • July 1st, 2026
Take epithelial cell monolayers. Add diluted supernatants from a virus-infected mouse tissue homogenate.
Incubate for viral adsorption, then wash.
Cover the cells with agar-containing medium, forming a semisolid overlay, and incubate.
The virus enters cells, replicates, and lyses them, releasing new viruses.
The solidified agar restricts viral spread, forming clear zones called plaques.
Remove the overlay. Treat with a fixative to inactivate viruses.
Add a permeabilization buffer to disrupt cell membranes.
Add a blocking buffer to prevent non-specific interactions.
Add primary antibodies. Incubate to allow their interactions with viral nucleocapsid proteins.
Wash and add biotin-conjugated secondary antibodies that bind to the primary antibodies.
Rinse and introduce avidin-biotin-peroxidase complexes, which bind to biotin on the secondary antibodies.
Add chromogenic substrates that react with peroxidase to produce brown precipitates, which stain the plaques.
Count the plaques at different dilutions to quantify the viral load in the tissue sample.
Utilizing the supernatant obtained from the tissue homogenates, perform tenfold serial dilution and infect confluent monolayers of Vero E6 cells with one milliliter of each supernatant dilution in triplicates.
Let the virus adsorb for one hour at 37 degrees Celsius in a humidified 5% carbon dioxide incubator. Once done, wash the cells with one milliliter of 1X PBS and then incubate the cells in two milliliters of post-infection media containing 1% agar in the humidified 5% carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius for 72 hours. After the incubation, inactivate the plates in 10% neutral buffered formalin for 24 hours at four degrees Celsius, ensuring the entire plate is submerged.
Take plates out of biosafety level three and wash the cells three times with one milliliter of 0.5% Triton X-100 for 10 minutes at room temperature. Next, block the permeabilized cells with one milliliter of 2.5 bovine serum albumin or BSA and PBS for one hour at 37 degrees Celsius, followed by incubation in one milliliter of one microgram per milliliter of the SARS-CoV nucleocapsid protein cross-reactive monoclonal antibody 1C7C7 diluted in 2.5 BSA for one hour at 37 degrees Celsius. Wash the cells three times with one milliliter of 1X PBS and develop the plaques using the ABC and diaminobenzene, or DAB, peroxidase substrate kits according to the manufacturer's instructions, then calculate the viral titers as plaque forming units per milliliter.
Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant de quantifier les charges virales infectieuses de SARS-CoV-2 dans des échantillons de tissus provenant de souris transgéniques K18 hACE2 à l'aide d'un dosage par plaques. La méthode consiste à infecter des monocouches de cellules épithéliales avec des surnageants d'homogénats de tissus, suivie d'une immunomarquage et d'un décompte des plaques afin de déterminer les titres viraux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Virologie
- Recherche sur les maladies infectieuses
- Dosages viraux quantitatifs
Contexte
- La quantification précise du virus infectieux dans les tissus est essentielle pour évaluer la pathogenèse virale et les interventions thérapeutiques.
- Les dosages par plaque constituent la méthode de référence pour mesurer les particules virales infectieuses.
- Les souris transgéniques K18 hACE2 sont un modèle largement utilisé pour les études d'infection par le SARS-CoV-2.
- L'immunomarquage améliore la visualisation et la spécificité des plaques.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour quantifier l'infection par le SARS-CoV-2 dans les tissus murins.
- Permettre une mesure reproductible des titres viraux à l'aide de dosages par plaque et d'immunomarquage.
- Faciliter les études sur la pathogenèse virale et l'efficacité des interventions dans des modèles murins transgéniques.
Méthodes utilisées
- Préparation d'homogénats tissulaires à partir de souris infectées par le virus.
- Dilution sérielle par facteur dix des surnageants et infection de monocouches de cellules Vero E6.
- Inkubation avec une couche de recouvrement contenant de l'agar pour limiter la propagation virale et former des plaques.
- Fixation, perméabilisation et blocage des cellules.
- Immunomarquage à l'aide d'anticorps primaires et secondaires conjugués à la biotine ciblant la protéine de nucléocapside virale.
- Visualisation à l'aide d'un complexe peroxydase-avidine-biotine et d'un substrat chromogène (DAB).
- Comptage des plaques et calcul des titres viraux en unités formant des plaques par millilitre.
Résultats principaux
- Des plaques claires et dénombrables se forment dans les monocouches de cellules infectées.
- L'immunomarquage avec des anticorps spécifiques de la nucléocapside améliore la détection des plaques.
- Les titres viraux peuvent être quantifiés avec précision à partir d'échantillons tissulaires.
- Le protocole est reproductible et adapté aux laboratoires en conditions de haute confinement.
Conclusions
- Le protocole d'essai de plaques décrit permet une quantification précise du SARS-CoV-2 infectieux dans les tissus de souris.
- L'immunomarquage améliore la spécificité et la clarté de la visualisation des plaques.
- Cette méthode permet une évaluation rigoureuse des infections virales et des études d'intervention chez des modèles de souris transgéniques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La quantification de la charge virale dans les tissus de souris infectées par dosage des plaques constitue une méthode de référence offrant une mesure quantitative du virus infectieux, permettant ainsi une validation solide des cibles et une réduction des risques mécanistiques dans le développement d'antiviraux&D. Cette méthode permet une mesure précise de la réplication virale et de l'efficacité des interventions, fournissant des informations essentielles pour les décisions prises lors des phases précoces de la découverte et du développement préclinique. Sa reproductibilité et sa spécificité sont cruciales pour le tri des portefeuilles de projets et la continuité translationnelle dans les filières de maladies infectieuses.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation quantitative d'hypothèses antivirales dans des modèles murins pertinents pour la maladie.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles virales en mesurant la production infectieuse.
- Apporte une détection mécanistique des risques en distinguant les particules virales infectieuses des particules non infectieuses.
- Facilite une confiance prédictive dans l'engagement de la cible et les effets des interventions.
Développement de tests et criblage
- Fournit des mesures quantitatives validées de la charge virale pour les procédés de criblage en aval.
- Standardise les conditions de dosage afin d'assurer la reproductibilité et la comparabilité entre études.
- Permet une montée en échelle et une réutilisation de la plateforme pour l'évaluation de composés dans des environnements à confinement élevé.
- Facilite un développement robuste des dosages grâce à une détection des plaques améliorée par immunomarquage.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles in vivo pertinents pour la maladie afin de développer des biomarqueurs translationnels.
- Assure la continuité depuis la découverte jusqu'à la validation préclinique de l'efficacité antivirale.
- Réduit les risques liés aux décisions d'avancement en fournissant des lectures quantitatives de l'infectiosité.
- Permet une compréhension mécanistique de la pathogenèse virale dans les systèmes modèles.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole de dosage par plaque s'intègre dès la phase de découverte précoce jusqu'à la recherche préclinique, permettant la vérification d'hypothèses, le criblage et la validation translationnelle dans les flux de travail relatifs aux maladies infectieuses.
- Biologie de la découverte : Quantifie la production virale infectieuse afin d'appuyer les tests d'hypothèses et la réduction des risques biologiques.
- Tri : Fournit des résultats d'essai reproductibles et quantitatifs pour l'évaluation des composés.
- Analytique : Permet la comparaison statistique des charges virales entre différentes conditions expérimentales et interventions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les résultats in vitro et in vivo pour l'alignement des biomarqueurs et de l'efficacité.
- Réutilisation institutionnelle : Offre une plateforme standardisée et réutilisable de quantification des virus infectieux applicable à l'ensemble des programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive et une validation ciblée grâce à des lectures quantitatives de l'infectiosité.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des tests dans les laboratoires à haute sécurité.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'orientation (go/no-go) et réduit les risques biologiques en phase avancée dans les portefeuilles d'antiviraux.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des candidats antiviraux.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite des connaissances spécialisées en virologie et une expérience des procédures en milieu à haute sécurité (NBL-3).
- Suppose l'accès à des équipements spécialisés pour la culture cellulaire, l'immunomarquage et la visualisation des plaques.
- Exige une standardisation rigoureuse entre les équipes afin d'assurer la reproductibilité et la comparabilité des données.
- Peut nécessiter des adaptations selon les souches virales ou les types de tissus, dans la mesure où le protocole le permet.
- Les limites pratiques incluent les exigences de biosécurité et les contraintes de débit inhérentes au comptage manuel des plaques.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026