Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 2:54 min • August 31st, 2026
Prendre un œil prélevé sur un modèle murin présentant une barrière rétinienne altérée, préalablement injecté avec un virus adéno-associé portant le gène de la protéine fluorescente verte.
La barrière rétinienne compromise permet aux AAV de pénétrer dans les cellules photoréceptrices, où le génome viral est exprimé pour produire la GFP, rendant ainsi les cellules fluorescentes.
Disséquer l'œil pour enlever la cornée et le cristallin, en laissant la cupule oculaire intacte.
Immerse le fond d'œil dans une solution fixative pour préserver la structure de la rétine.
Transférez l'œil dans des solutions de cryoprotecteur de concentrations croissantes de manière séquentielle. Incubez ultérieurement dans la concentration finale afin d'empêcher la formation de cristaux de glace.
Incorporez la cupule oculaire dans un milieu cryogénique et congélez-la.
À l'aide d'un cryostat, découper l'œil en tranches fines.
Monter la section sur une lame. Ajouter un tampon contenant des détergents pour perméabiliser le tissu et permettre l'accès des anticorps lors de l'immunomarquage ultérieur.
Rincez la section. Traitez-la avec une solution de blocage pour éviter les interactions non spécifiques des anticorps lors de l'immunomarquage.
La cryosection de la rétine est prête pour des procédures supplémentaires d'immunomarquage et d'imagerie en fluorescence. Les cellules fluorescentes positives pour la GFP révèlent une transduction virale réussie, indiquant la perméabilité rétinienne.
Après avoir prélevé les yeux d'un animal injecté euthanasié, disséquez les yeux pour enlever le cristallin et la cornée. Ensuite, fixez par immersion l'œil disséqué dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant une heure. Après une heure, protégez les yeux par congélation dans du saccharose à 10 % pendant encore une heure à température ambiante. Puis, faites tremper les yeux dans du saccharose à 20 % pendant un tiers d'heure à température ambiante.
Enfin, laissez les yeux dans une solution de saccharose à 30 % toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, incluez et congélez les cupules oculaires dans une résine d'inclusion telle que la matrice cryo. Ensuite, à l'aide du cryostat, réalisez des sections de 10 micromètres et montez-les sur des lames préparées pour les tissus congelés.
Perméabilisez maintenant les sections sur les lames avec un détergent pendant cinq minutes. Effectuez ensuite deux brèves lavages dans le PBS. Bloquez ensuite les yeux pendant une heure à température ambiante.