JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 2:24 min • August 31st, 2026
Commencez avec l'œil d'une souris transgénique préalablement injectée avec un virus adéno-associé (AAV) portant le gène d'intérêt qui code une protéine fluorescente.
La souris ne possède pas un gène essentiel au maintien de l'intégrité de la membrane limitante interne (ILM), une barrière qui sépare la rétine de la cavité vitrée.
La perte de ce gène imite une dégénérescence rétinienne, permettant au virus de pénétrer plus profondément dans les couches cellulaires de la rétine.
Les cellules rétiniennes infectées expriment le gène d'intérêt, produisant des protéines fluorescentes, ce qui leur permet de fluorescer.
Maintenant, disséquez l’œil et retirez la cornée et le cristallin.
Détacher soigneusement la rétine de l'épithélium pigmentaire de la rétine (RPE) et de la sclère, la couche externe de l'œil.
Immerger le tissu dans le fixateur.
Laver avec du tampon phosphate pour éliminer le fixateur résiduel.
Lorsqu'on les observe au microscope confocal, la fluorescence dans les cellules rétiniennes indique une pénétration virale réussie à travers la membrane limitante interne compromise.
Pour les montages plats de la rétine, faciliter la dissection en fixant les yeux énucléés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 à 30 minutes. Cette fixation, ainsi que celle effectuée après la dissection, doivent être réalisées correctement car elles sont essentielles pour préserver la fluorescence de la GFP. Dans un délai de 15 à 30 minutes suivant la période de fixation, disséquer les yeux, retirer la cornée et le cristallin.
Séparez la rétine de l'épithélium pigmentaire rétinien et de la sclère en coupant autour de l'ora serrata et du nerf optique. Après la dissection, immergez les rétines dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant encore 30 minutes pour fixer le tissu et la protéine fluorescente dans les cellules rétiniennes transduites. Après la fixation, lavez l'échantillon pendant cinq minutes dans du PBS stérile à pH 7,4.