JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 3:24 min • August 31st, 2026
Prenez des tubes contenant des capsides virales, qui sont des particules semblables à des virus mais dépourvues de matériel génétique.
Chauffer les tubes à une température constante pendant des durées variables.
Une durée de chauffage plus courte exerce un léger stress sur les protéines de la capside, tandis qu'un chauffage prolongé perturbe la capside et provoque une agrégation.
Refroidir rapidement les tubes pour éviter d'autres modifications structurelles.
Transférez le liquide sur un film de paraffine.
Placer une grille de microscopie électronique en transmission (MET) sur la goutte. Les capsides s'attachent à la surface de la grille.
Éponger la grille avec un papier filtre pour éliminer le liquide en excès.
Lavez à l’aide d’un tampon pour éliminer les capsides faiblement attachées, puis essuyez à nouveau la grille.
Immerger dans l'acétate d'uryle, un colorant métallique lourd qui se lie à la surface du capsidique, les rendant ainsi plus sombres en MET.
Étampez la grille et placez-la sur une plaque. Conservez la plaque dans un dessiccateur pour éliminer l'humidité.
Imager la grille à l'aide de la MET afin de visualiser les dommages aux capsides induits par la chaleur.
Effectuer le traitement thermique comme précédemment, sauf remplacer le PBS par du HEPES 10 millimolaire, pH 7,4, et ne pas diluer davantage les capsides après le traitement. Ensuite, prélever par pipette la totalité de la goutte de 15 microlitres de solution de capsides traitée et la déposer sur un film de paraffine. Saisir le bord de la grille avec des pinces en laissant les mâchoires se refermer sur le bord pour maintenir la grille, puis placer la grille, côté carbone vers le bas, au-dessus de la goutte de solution traitée.
Laisser le quadrillage en incubation pendant 10 minutes afin que la capside s'attache au quadrillage. Selon la pureté de la préparation des capsides, ajouter des lavages avec la solution de HEPES sous forme de gouttelettes de 10 à 15 microlitres placées en ligne après la gouttelette de capsides traitée. Après 10 minutes, prélever le quadrillage avec la gouttelette.
Placez la grille presque perpendiculairement à un morceau de papier filtre pour absorber la goutte. Ensuite, utilisez la grille pour prélever la goutte de 10 à 15 microlitres de tampon HEPES et maintenez-la pendant 30 secondes. Après 30 secondes de lavage, absorbez-la avec un autre morceau de papier filtre.
Ensuite, déposez une goutte de 15 microlitres de solution d'acétate d'uryle à deux pour cent sur la pellicule de paraffine dans une zone vide. Prélevez la goutte d'acétate d'uryle avec la grille et maintenez-la pendant 45 secondes. Puis, aspirez l'acétate d'uryle en veillant à éliminer la majeure partie de la solution.
Placer la grille côté carbone vers le haut sur un morceau de papier filtre en veillant à ce que la grille n'adhère pas à l'humidité des pinces. Ensuite, placer le papier filtre avec la grille dans une boîte de Pétri en verre ouverte. Après avoir répété ce processus pour tous les traitements, placer les demi-boîtes de Pétri contenant les grilles dans un dessiccateur toute la nuit pour les faire sécher avant l'observation en MET.