Phage Purification from Borrelia burgdorferi
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 4:30 min • July 31st, 2026
Take a suspension of Borrelia burgdorferi bacteria infected with a borrelial phage.
Centrifuge the suspension and collect the supernatant containing phage particles and cellular debris.
Add a salt solution and incubate with shaking.
The salt solution enables the separation of residual host-derived macromolecules from the phage particles.
Centrifuge the suspension and collect the supernatant containing the phage particles.
Add polyethylene glycol or PEG, which acts as a molecular crowding agent that facilitates phage particle precipitation.
Incubate on ice and then centrifuge.
Discard the supernatant.
Resuspend the pellet in a buffer, then transfer it to a microcentrifuge tube.
Treat with chloroform to dissolve lipid-based cell debris.
Centrifuge the tube and collect the upper aqueous phase containing the borrelial phages.
Repeat the chloroform addition, mixing, centrifugation, and collection steps to ensure complete removal of contaminants.
Store the isolated phage particles under cold conditions for further use.
Supplement the prepared culture with the appropriate antibiotic concentration described in the manuscript, while incubating the sample at 33 degrees Celsius for 72 to 96 hours. To prepare solutions for PEG precipitation, prepare 500 milliliters of five molar sodium chloride, 500 milliliters of 40% PEG, and 100 milliliters of suspension medium as described in the manuscript. To sterilize, autoclave the solution, cool prior to use, and store at room temperature or four degrees Celsius.
For PEG precipitation of phage from the donor Borrelia burgdorferi clone, after 72 to 96 hours of incubation, centrifuge the samples at 8,000 g for 20 minutes at four degrees Celsius. Decant the supernatant into a clean, 50-milliliter conical tube and dispose of the cell pellet. Add five molar sodium chloride to a final concentration of one molar.
After mixing well, rock gently at room temperature for one hour. Centrifuge the samples at 8,000 g for 10 minutes at four degrees Celsius. After decanting the supernatant into a clean 50-milliliter conical tube as demonstrated previously, add 40% PEG-8000 solution to the supernatant to a final concentration of 10%. Mix well and set on ice for more than one hour, up to overnight.
Centrifuge the samples at 8,000 g for 20 minutes at four degrees Celsius as demonstrated previously. Discard the supernatant and remove as much excess liquid as possible without losing any pellet, which contains the phage particles. Resuspend the pellet in a minimal volume of suspension medium using the suspension medium to wash down the side of the bottle and collect any potential phage particles.
Treat the recovered phage sample with an equal volume of chloroform based on the volume of resuspension. Mix the sample well and centrifuge at 8,000 g for 10 minutes. Then, remove the aqueous layer to a clean tube, avoiding any of the thick interface layers.
After determining the volume recovered following the first chloroform treatment, again treat the sample with an amount of chloroform equal to 10% of that volume. Transfer the aqueous layer to a clean tube while being careful to avoid any of the interface or organic layers. Use the phage immediately or store it at four degrees Celsius.
Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant d'isoler des particules de phages boréliens à partir de suspensions de Borrelia burgdorferi par précipitation au polyéthylène glycol (PEG) et extraction au chloroforme. Cette méthode permet aux chercheurs d'obtenir des particules de phages purifiées pour la manipulation génétique en aval et l'étude du spirochète responsable de la maladie de Lyme.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Biologie moléculaire
- Recherche sur les bactériophages
Contexte
- Borrelia burgdorferi est l'agent responsable de la maladie de Lyme.
- La manipulation génétique médiée par des phages est un outil précieux pour l'étude de la génétique bactérienne.
- L'isolement efficace de particules de phage est essentiel pour les études génétiques et leurs applications.
- La précipitation par PEG et l'extraction au chloroforme sont des méthodes établies pour la purification des phages.
Objectif de l'étude
- Démontrer un protocole fiable pour isoler des particules de bactériophages boréliens à partir de cultures infectées de B. burgdorferi.
- Fournir des étapes détaillées pour la purification des phages, adaptées à des expériences de manipulation génétique.
- Garantir l'élimination des débris cellulaires et des contaminants présents dans les préparations de phages.
Méthodes utilisées
- Centrifugation de suspensions infectées par B. burgdorferi pour séparer le surnageant contenant les phages.
- Ajout d'une solution saline pour faciliter la séparation des macromolécules de l'hôte.
- Précipitation des particules phagiques par PEG, suivie d'une incubation sur glace et d'une nouvelle centrifugation.
- Extraction au chloroforme pour éliminer les débris d'origine lipidique, avec des étapes répétées afin d'assurer la pureté.
- Resuspension du culot de phages dans un tampon et stockage à froid.
Résultats principaux
- Isolation et concentration réussies de particules de bactériophages boréliens à partir de cultures bactériennes.
- Élimination efficace des débris cellulaires et des contaminants par centrifugation séquentielle et extraction au chloroforme.
- Préparation de bactériophages purifiés prêts à l'emploi ou pouvant être stockés au froid.
- Le protocole permet des applications en aval dans la manipulation génétique de B. burgdorferi.
Conclusions
- Le protocole décrit permet une isolation efficace et reproductible de particules de phages boréliens.
- La précipitation par PEG combinée à une extraction au chloroforme donne des préparations de phages de haute pureté.
- Cette méthode facilite les études génétiques avancées chez B. burgdorferi et dans les recherches connexes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La purification efficace de particules de bactériophages boréliens à partir de cultures de Borrelia burgdorferi permet une manipulation génétique précise et des études fonctionnelles dans le cadre de la recherche sur la maladie de Lyme. Cette capacité soutient la validation précoce des cibles et la réduction des risques mécanistiques pour les portefeuilles de maladies infectieuses. Une isolation fiable des phages est essentielle à des protocoles reproductibles pour le développement d'outils génétiques et la recherche translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation de la fonction des gènes et l'analyse des voies métaboliques chez B. burgdorferi.
- Contribue à l'atténuation des risques biologiques en fournissant des phages purifiés pour la manipulation génétique.
- Facilite une confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à des études génétiques contrôlées.
Développement de criblages et de tests
- Fournit des stocks de phages de haute pureté pour des tests génétiques standardisés.
- Améliore la reproductibilité et la précision quantitative des analyses en aval.
- Permet une préparation évolutive d'outils génétiques destinés à des plateformes d'évaluation de composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Permet le développement de modèles génétiques pertinents pour la recherche sur la maladie de Lyme.
- Assure une continuité entre la découverte et la validation préclinique en permettant des modifications génétiques précises.
- Réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études translationnelles grâce à une manipulation fiable médiée par des phages.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole de purification de phages s'inscrit à l'interface entre la découverte précoce et le développement d'outils génétiques, en soutenant des flux de travail allant de la vérification d'hypothèses à la génération de modèles précliniques.
- Découverte en biologie : Permet une manipulation génétique orientée par des hypothèses et la clarification de voies métaboliques chez B. burgdorferi.
- Écrantage : Fournit des stocks de phages reproductibles et de haute pureté pour le développement et la validation de tests.
- Analytique : Fournit des rendements quantitatifs de phages et des mesures de pureté permettant des comparaisons entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Facilite la génération de souches génétiquement modifiées pour des études pertinentes sur les maladies.
- Réutilisation en entreprise : Met en place un protocole standardisé et réutilisable de purification de phages applicable à différents projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'incertitude mécanistique dans les études génétiques.
- Valeur opérationnelle : Normalise la purification des phages pour assurer la reproductibilité et la montée en échelle.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en permettant la génération d'outils génétiques robustes.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des programmes de recherche sur les maladies infectieuses.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biologie des phages et en techniques de microbiologie moléculaire.
- Suppose l'accès à des infrastructures de centrifugation, de stockage à froid et de manipulation de produits chimiques.
- Exige une standardisation entre équipes pour obtenir des rendements et une pureté reproductibles des phages.
- Peut nécessiter des adaptations selon les hôtes bactériens ou les types de phages.
- Dépend d'étapes minutieuses de séparation des phases et d'élimination des contaminants.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026