JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 2:28 min • August 31st, 2026
Prenez une culture de bactéries spirochètes génétiquement modifiées. Ces bactéries portent le gène de résistance à la gentamicine.
Ajouter une suspension de bactériophages à la culture bactérienne.
Les phages portent un ADN plasmidique codant pour un gène de résistance à la kanamycine.
Incuber le mélange.
Le bactériophage s'attache à la surface bactérienne et injecte l'ADN dans la cellule.
Le plasmide se réplique de manière indépendante et est transmis lorsque les bactéries se divisent.
Mélanger la culture incubée avec un milieu à l'agarose fondu supplémenté avec les antibiotiques gentamicine et kanamycine.
Verser le mélange dans une plaque. Laisser durcir, puis incuber.
Sous une sélection par double antibiotique, seules les cellules portant les deux marqueurs de résistance poussent et forment des colonies, tandis que les cellules restantes meurent.
Prélevez une colonie et inoculez-la dans un milieu contenant les deux antibiotiques.
Incuber pour favoriser la croissance des bactéries contenant le plasmide transduit en vue d'une analyse ultérieure.
Versez le surnageant et resuspendez le culot dans 14,5 millilitres de BSK frais. Ajoutez moins de ou égal à 500 microlitres d'échantillon de bactériophage précipité avec du PEG à la culture du clone récepteur.
Après un bon mélange, incuber à 33 degrés Celsius pendant 72 à 96 heures. Réaliser la sélection des transductants par ensemencement en phase solide après mélange avec le bactériophage précipité au PEG, comme décrit dans l'article. Selon le fond génétique du clone receveur, vérifier que les colonies apparaissent dans l'agarose des boîtes de sélection après 10 à 21 jours d'incubation.
Prélevez au moins 5 à 10 colonies qui se développent sur la boîte en présence des deux antibiotiques à l’aide d’une pipette en borosilicate stérile de 5,75 pouces munie d’un embout en coton, et ensemencez-les dans 1,5 millilitre de BSK contenant l’antibiotique approprié.