JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 2:40 min • August 31st, 2026
Prélevez des cultures de cellules cancéreuses du sein.
Co-infecter avec deux types d'adénovirus. L'un porte un gène de la protéine fluorescente verte ou GFP sous un promoteur activement constitutif.
L'autre contient un gène rapporteur codant pour la protéine fluorescente rouge ou RFP, sous un promoteur sensible aux SMAD.
Ajouter le TGF-bêta à la culture témoin et incuber.
Les virus se lient au récepteur pour pénétrer dans la cellule hôte, délivrent les gènes dans le noyau et permettent l'expression de la GFP.
Dans les cellules témoins, le TGF-bêta se lie à son récepteur et active la voie SMAD en phosphorylant les protéines SMAD2 et SMAD3.
Ces protéines forment un complexe avec SMAD4.
Ce complexe se lie au promoteur du gène rapporteur, permettant l'expression de la protéine fluorescente rouge (RFP) en plus de celle de la protéine fluorescente verte (GFP).
Dans le témoin, la voie de signalisation SMAD reste inactive, permettant aux cellules d'exprimer uniquement la GFP.
Capturer des images fluorescentes de cellules vivantes.
La présence des deux signaux confirme l'activation de la voie SMAD par transduction double à l'aide d'adénovirus.
Le jour de l'infection par l'adénovirus, ensemencer les puits d'une plaque de 12 puits avec environ 1,25 fois 10 à la puissance 5 cellules MDA-MB-231 dans 500 microlitres de milieu pour obtenir une confluence de 35 %. Infecter les cellules de tous les puits avec 75 microlitres d'adénovirus-CMV-GFP et 7,5 microlitres d'adénovirus CAGA12-Td-Tomato afin d'obtenir un indice de multiplicité d'infection (MOI) de 2 500, ce qui permet d'atteindre une positivité d'infection de 100 %. Ajouter ensuite le TGF-bêta au puit de traitement immédiatement après l'infection par l'adénovirus.
Incuber à 37 degrés Celsius avec 10 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Le lendemain, observer les cellules vivantes au microscope à fluorescence en contraste de phase.