Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 2:36 min • August 31st, 2026
Commencer avec des lymphocytes humains infectés par le VIH-1 sur une lame couvre-objet fixée sur une lame porte-objet.
Ces cellules ont été hybridées avec des sondes qui marquent de manière fluorescente l'ARN viral et l'ADN proviral.
Incuber les cellules dans une solution de blocage pour éviter la liaison non spécifique des anticorps.
Introduire les anticorps primaires ciblant la protéine de capside du VIH-1.
Incuber pour permettre aux anticorps primaires de se lier à la protéine de capsides.
Laver les cellules avec du tampon pour éliminer les anticorps non liés.
Ajouter des anticorps secondaires marqués avec un fluorochrome qui se lient aux anticorps primaires.
Laver les anticorps non liés.
Ajouter un colorant spécifique de l'ADN pour colorer les noyaux des cellules, puis rincer pour éliminer l'excès de colorant.
Utilisez une imagerie de fluorescence multiplexée pour détecter simultanément l'ADN viral, l'ARN, les protéines et les noyaux de l'hôte en couleurs distinctes.
Cette visualisation au niveau de la cellule unique permet l'étude des différents stades du cycle de vie viral grâce à la visualisation simultanée de l'ADN viral, de l'ARN viral et des protéines virales dans les cellules infectées.
Pour l'immunomarquage des protéines d'intérêt, après le dernier lavage, traiter chaque lame avec 200 microlitres de tampon de blocage pendant une heure d'incubation à température ambiante.
À la fin de l'incubation, décantez le tampon de blocage et ajoutez 200 microlitres d'anticorps primaire d'intérêt dilué dans du PBS additionné de Tween 20 et complété avec 1 % d'albumine de sérum bovin. Après une incubation d'une heure à température ambiante, lavez les lames par deux rinçages de 10 minutes chacun dans du PBS frais additionné de Tween 20, sous agitation pour chaque rinçage, avant de marquer les échantillons avec un anticorps secondaire approprié pendant une heure à température ambiante. À la fin de l'incubation, lavez les lames deux fois avec du PBS frais additionné de Tween 20 pendant 10 minutes chacun, sous agitation pour chaque rinçage.
Après le deuxième lavage, contre-tailler les noyaux avec un colorant nucléaire approprié pendant une minute à température ambiante, suivi de deux lavages dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante sous agitation.