Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 3:36 min • August 31st, 2026
Commencez avec une suspension contenant des précipités d'intégrasomes du virus foamy prototype ou PFV, d'intégrases monomériques, d'oligomères d'ADN et d'agrégats protéiques.
Les intasomes de PFV sont des tétramères d'intégrases virales associés à des oligomères synthétiques qui imitent l'ADN génomique viral.
Ajouter une solution saline à la suspension et incuber sur de la glace. Le sel réduit les interactions électrostatiques entre les intasomes, permettant ainsi la solubilisation des précipités.
Pipeter doucement à intervalles réguliers pour favoriser la solubilisation de l'intasome.
Centrifuger pour former un culot du précipité restant et recueillir le surnageant contenant les intasomes solubles.
Prenez une colonne de chromatographie d'exclusion stérique pré-équilibrée, remplie de billes d'agarose réticulée, et chargez le surnageant sur la colonne.
En raison de leur grande taille, les agrégats protéiques et les intasomes contournent les pores des billes et éluent plus tôt.
Les intégrases monomériques plus petites et les oligomères pénètrent dans les pores des billes et éluent plus tard.
Recueillir les fractions éluées en début d'élution contenant les intasomes pour des analyses en aval supplémentaires.
Préparez deux pointes de pipette à grand orifice en retirant deux à quatre millimètres de l'extrémité d'une pointe de 200 microlitres à l'aide d'un rasoir ou d'une lame de scalpel neuf sur une surface propre. Retirez le tube de dialyse du tampon de dialyse. Afin d'éviter la dilution de l'échantillon d'intasome par le tampon de dialyse qui pourrait rester à l'extrémité du tube près du clip, utilisez une micropipette équipée d'une petite pointe pour éliminer tout excès de tampon de dialyse.
Retirer la pince à cette extrémité du tube de dialyse. Lors de la récupération de l'assemblage, il est important de recueillir autant que possible la solution et le précipité. Utiliser la pipette à orifice large pour transférer l'échantillon, y compris le précipité, à l'intérieur du tube de dialyse, dans un tube de 1,5 millilitre placé sur de la glace.
Noter le volume total du matériau récupéré. Le volume total est généralement d'environ 140 microlitres. L'échantillon contenant le précipité est à 200 millimolaire de chlorure de sodium.
Augmenter la concentration en sel jusqu'à une concentration finale de 320 millimolaire de chlorure de sodium en ajoutant le volume approprié d'une solution mère de chlorure de sodium à cinq molaire. Transférer le seau à glace contenant l'échantillon dans une chambre froide à quatre degrés Celsius. Utiliser la pipette à orifice large pour resuspendre et solubiliser le précipité par pipetage.
Répéter toutes les 20 minutes pendant au moins une heure. La majeure partie du précipité doit passer en solution. Pour purifier l'intasome, équilibrer une colonne de chromatographie d'exclusion stérique (SEC) en agarose réticulée avec le tampon de migration SEC à un débit de 0,4 millilitre par minute.
Centrifuger l'échantillon d'intasome dans une microcentrifugeuse à 14 000 ×g pendant 10 minutes à 4 °C pour former un culot avec tout précipité restant. Après avoir soigneusement prélevé le surnageant, charger celui-ci sur une boucle d'injection de 200 µL. Appliquer l'échantillon sur la colonne de chromatographie d'exclusion stérique (SEC).
Éluer avec 25 millilitres de tampon de migration SEC et recueillir 95 fractions de 270 microlitres. Observer que le chromatogramme SEC présente trois pics à 280 et 260 nm.