Obtention de l'ARN viral pour l'analyse par réaction de polymérisation en chaîne quantitative en temps réel (qPCR)

Commencez par une solution standard d'ARN viral synthétisé diluée en série dans le milieu de culture.

Ces dilutions servent de standards de référence pour quantifier l'ARN viral dans les échantillons.

Prélève maintenant le surnageant contenant le virus à partir de la culture cellulaire infectée par le virus.

Ce milieu de culture contient un inhibiteur qui se lie aux enzymes dégradant l'ARN et empêche la dégradation de l'ARN viral.

Ajouter le tampon de traitement contenant l'enzyme protéinase K.

Centrifuger brièvement la solution pour un mélange homogène.

Placer la plaque PCR contenant les échantillons dans le thermocycleur.

Commencez par une incubation à une température modérée afin d'activer la protéinase K.

Cet enzyme digère les protéines virales qui encapsulent le génome, libérant ainsi l'ARN viral dans la solution.

Ensuite, incuber à une température plus élevée pour inactiver l'enzyme et dénaturer l'ARN.

Enfin, conserver les échantillons traités dans des conditions froides jusqu'à l'analyse par PCR quantitative en temps réel.

Commencez par mélanger 199 microlitres de tampon de traitement avec un microlitre de protéinase K sans nucléase. À l'aide de milieu de culture cellulaire, diluez sériellement l'ARN de la région UTR trois prime du virus de la dengue préparé de un à dix pour obtenir des étalons d'ARN à des concentrations allant de 5 000 000 à 5 000 copies par microlitre, en répétant les opérations de pipetage et de vortex. Transférez 5 microlitres du surnageant de culture des cellules infectées par le virus de la dengue et de l'étalon d'ARN de la région UTR trois prime du virus de la dengue soit dans des bandes PCR A2, soit dans les puits d'une plaque PCR 96-puits.

Mélanger cinq microlitres de la solution contenant le tampon de traitement et la protéinase K. Faire une courte centrifugation à 200 ×g pendant cinq secondes. Incuber les échantillons dans un thermocycleur à 25 °C pendant dix minutes, puis à 75 °C pendant cinq minutes.