Purification du virus à partir du liquide allantoïde d'œufs de poule embryonnés

Commencez avec un réservoir contenant du liquide allantoïque récolté à partir d'œufs de poule infectés par le virus.

Ce fluide contient des particules virales ainsi que des contaminants d'origine hôte.

Faites passer le liquide à travers un filtre de profondeur afin de capturer les contaminants de grande taille tout en laissant passer les contaminants plus petits et les virus.

Ensuite, chargez le liquide filtré dans un système de filtration, où il s'écoule de manière tangentielle à la surface d'une membrane.

Les contaminants plus petits traversent la membrane, tandis que le virus est retenu et concentré.

Chargez le virus concentré sur un gradient de densité et centrifugez-le. Le virus forme une bande distincte là où sa densité correspond à celle du gradient.

Prélevez la bande riche en virus dans une cassette de dialyse et placez-la dans un tampon. Les composants du gradient diffusent vers l'extérieur, tandis que l'eau du tampon diffuse à l'intérieur à travers la membrane semi-perméable.

Ensuite, placez la cassette dans une solution hypertonique pour extraire l'eau et concentrer le virus purifié.

Pour la purification du virus de la maladie de Newcastle ou NDV, commencez par amorcer le système expérimental préalablement mis en place en faisant circuler 50 millilitres de PBS à travers celui-ci.

Arrêtez la pompe lorsqu'il reste environ cinq millilitres de PBS dans le tube. Ensuite, fixez un filtre de profondeur ayant une capacité de rétention de un à trois micromètres au tube. Pour dégazer le filtre, retirez le deuxième bouchon du côté apical du filtre de profondeur, puis faites circuler un volume supplémentaire de 50 millilitres de PBS à travers le système.

Dès que le PBS commence à s'écouler par l'orifice situé en haut du filtre, fermez le port et continuez à faire circuler le PBS dans les conduites. Ensuite, remplacez le récipient de déchets par un nouveau récipient stérile de collecte et commencez à faire passer le liquide allantoïque à travers le filtre de profondeur. Puis, configurez le système de filtration tangentielle (ou TFF) en configuration ouverte et faites-le fonctionner comme décrit dans le manuscrit.

Lorsqu'il reste environ cinq millilitres de liquide dans le réservoir, arrêtez la pompe et ajoutez du liquide allantoïque filtré en profondeur dans le réservoir. Ensuite, reprenez l'écoulement de la pompe. Pour éviter la fragmentation du virus, il est important de s'assurer que la pression du système ne dépasse pas 10 livres par pouce carré.

Pour augmenter l'élution, une combinaison de la vitesse de la pompe péristaltique et de l'utilisation d'attaches en C doit être employée. Laisser 150 à 100 millilitres de liquide allantoïque dans le réservoir, arrêter la pompe et remplacer le tampon en ajoutant 150 à 200 millilitres de tampon ML. Arrêter à nouveau la pompe lorsque cinq à dix millilitres de liquide restent dans le réservoir, puis fermer les lignes de déchet à l’aide de deux attaches en C.

Détachez la ligne de rétention alimentant le réservoir et insérez-la dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, rétablissez le débit et faites une pause lorsque quelques gouttes de liquide seulement restent dans le réservoir. Puis, retirez les pinces en C des lignes de déchet et reconnectez la ligne d'alimentation du rétention au réservoir.

Pendant ce temps, pour préparer la centrifugation ultracentrifuge sur gradient de densité d'iodixanol, ajoutez d'abord 0,5 millilitre d'iodixanol à 40 % dans un tube d'ultracentrifugeuse de 13,2 millilitres à paroi mince et à extrémité ouverte. Préparez ensuite la colonne en ajoutant successivement 2,5 millilitres d'iodixanol à 20 % et 2,5 millilitres d'iodixanol à 10 %. Avant l'ultracentrifugation, ajoutez soigneusement six à 6,5 millilitres de la solution virale éluée du système de filtration tangentielle continue (TFF) sur la colonne d'iodixanol sans perturber le gradient.

Après l'ultracentrifugation, retirez les tubes à l'aide d'une paire de forceps stériles. La bande cible doit être une bande large située entre les gradients de 10 et 20 %. Ensuite, suspendez le tube au-dessus d'un bécher à l'aide d'un support à anneaux.

Ensuite, fixez une aiguille de 1,5 pouce de calibre 18 à une seringue de cinq millilitres, puis percez le côté du tube d'ultracentrifugation avec l'aiguille et retirez la bande cible en étendant lentement le piston. Après avoir retiré l'iodixanol de la solution virale comme décrit dans le manuscrit, utilisez une seringue pour injecter soigneusement le virus dans une cassette de dialyse. Pour concentrer la solution virale, retirez la cassette de dialyse du tampon de dialyse et placez-la dans un petit sac en plastique hermétique.

Ensuite, ajouter de 15 à 25 millilitres de polyéthylène glycol à 40 % dans le sac afin que la cassette de dialyse soit complètement immergée.