Reprogrammation de cellules sanguines humaines en cellules souches pluripotentes induites médiée par le virus Sendai

Prélevez une culture de cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC).

Ajouter le virus Sendai codant pour les facteurs de transcription de reprogrammation. Couvrir et sceller la plaque.

Centrifuger pour améliorer le contact virus-cellule et incuber.

Après la fusion du virus, l'ARN viral exprime des facteurs de transcription qui activent les gènes de pluripotence cellulaire et répriment les gènes spécifiques à la lignée afin d'initier le reprogrammation.

Pendant cette étape, un sous-ensemble de PBMC transduits se transforme en cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et exprime des protéines d'adhérence.

Transférez-les dans un puits revêtu de matrice et centrifugez les cellules. Remplacez le surnageant par un milieu de croissance.

Après incubation, les iPSC adhèrent à la matrice, tandis que les PBMC transduits non adhérents restent en suspension.

Transférez la suspension dans un puits revêtu et centrifugez. Ajoutez le milieu dans le puits d'origine et incubez les deux.

Les PBMC transduits restants entament la reprogrammation, se transforment en iPSC et adhèrent. Cette étape maximise la rétention des cellules reprogrammées.

Remplacer le milieu chaque jour pour maintenir la croissance des iPSC.

Dans cette procédure, transférez les cellules sanguines dans un tube conique de 15 millilitres et comptez-les à l’aide d’un hématimètre. Ensuite, préparez 3 × 10⁵ cellules pour la transduction et centrifugez les cellules à 515 × g pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, éliminer le surnageant par aspiration et resuspendre les cellules dans 0,5 millilitre de milieu pour cellules sanguines. Puis, transférer les cellules dans un puits d'une plaque 24 puits non revêtue. Décongeler le mélange de virus Sendai sur de la glace et l'ajouter aux cellules en suspension.

Fermez la plaque avec un film d'étanchéité et centrifugez-la à 1 150 ×g pendant 30 minutes à 30 °C. Après la centrifugation, incubez les cellules à 37 °C sous 5 % de dioxyde de carbone toute la nuit. Le lendemain, pour revêtir une plaque à 24 puits de vitronectine, diluez la solution de vitronectine dans du PBS afin d'obtenir une concentration finale de 5 µg/mL.

Ensuite, ajoutez un millilitre de vitronectine dans un puits et incubez-le à température ambiante pendant au moins une heure. Après cette étape, retirez la solution de revêtement et transférez tout le milieu contenant les cellules et le virus dans le puits revêtu. Puis, récupérez les cellules restantes avec 0,5 millilitre supplémentaire de milieu frais pour cellules sanguines et ajoutez-le au puits contenant les cellules.

Ensuite, centrifuger la plaque à 1 150 × g pendant dix minutes à 35 °C, puis maintenir les cellules à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant la nuit. Pour le deuxième transfert cellulaire, recouvrir le puits de vitronectine à 5 µg/mL comme décrit précédemment. Utiliser un puits de la plaque pour chaque transduction, et transférer la suspension cellulaire depuis la première plaque vers la plaque de vitronectine nouvellement revêtue.

Entre-temps, ajoutez un millilitre de milieu pour les iPSC dans une cavité de la première plaque pour l'entretien, puis incubez à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone, avec un changement quotidien du milieu par du milieu frais pour les iPSC. Des colonies apparaîtront entre le jour 14 et le jour 21 après la transduction. Centrifugez la plaque nouvellement revêtue, contenant les cellules en suspension, à 1 150 × g et à 35 degrés Celsius pendant dix minutes.

Après la centrifugation, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone, pendant la nuit. Le lendemain, retirer le surnageant et le remplacer par un milieu frais pour les cellules souches pluripotentes induites. Maintenir les cellules attachées avec un renouvellement quotidien du milieu, jusqu'à atteindre une confluence de 80 %.