JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 3:41 min • August 31st, 2026
Commencez avec des tubes contenant des cellules épithéliales pulmonaires humaines.
Ajoutez des virus de la grippe biotinylés et incubez sur de la glace. Les virus se lient à la surface des cellules sans être internalisés.
Centrifuger pour séparer les cellules liées au virus, retirer le surnageant et resuspendre.
Dans le tube du point temporel initial, ajoutez de la streptavidine non marquée, qui se lie aux virus biotinylés, formant des complexes.
Ajouter de la streptavidine marquée par un fluorophore, qui ne parvient pas à se lier au complexe virus streptavidine-biotine. Laver et fixer les cellules.
Incubez le tube du point temporel ultérieur à une température plus élevée, permettant ainsi l'internalisation du virus, puis remettez-le sur glace.
Ajouter de la streptavidine non marquée et un agent bloquant l'internalisation, qui empêche la capture virale ultérieure, puis incuber. La streptavidine se lie aux virus biotinylés fixés à la surface, puis laver.
Fixer les cellules et ajouter un tampon contenant un détergent pour les perméabiliser.
Lavez et ajoutez la streptavidine marquée par un fluorophore, qui pénètre dans les cellules et se lie à la biotine.
Analyser les échantillons par cytométrie en flux.
Une fluorescence plus élevée au point temporel ultérieur confirme une internalisation virale réussie.
Après avoir répété le lavage une fois supplémentaire, refroidir les tubes sur de la glace pendant 10 minutes. Une fois les tubes refroidis, effectuer une nouvelle centrifugation et utiliser 100 microlitres de virus biotinylé dilué dans du PBS d'infection pour resuspendre les culots après une incubation d'une heure sur glace. Répéter ensuite la centrifugation et laver deux fois avec du PBS, en traitant les échantillons suivants en parallèle autant que possible pour les échantillons à zéro minute.
Pour traiter les échantillons à zéro minute plus STV, centrifuger les tubes, éliminer le surnageant et utiliser 15 microlitres de STV contenant 2 % de BSA et 0,1 % d'azoture de sodium dans du PBS pour resuspendre le culot cellulaire. Incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Puis centrifuger et laver les cellules deux fois avec du PBS après fixation au PFA comme vient d'être démontré, puis conserver les échantillons à quatre degrés Celsius.
Pour les échantillons de plus de 30 minutes avec STV. Après centrifugation, resuspendre les échantillons dans 200 microlitres de PBS contenant 2 % de BSA, puis effectuer une incubation à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Faire centrifuger et remettre en suspension les cellules dans 50 microlitres de STV contenant 2 % de BSA et 0,1 % d'azoture de sodium dans le tampon PBS, puis incuber sur de la glace pendant 30 minutes avant de laver et fixer. Ensuite, après perméabilisation et marquage de tous les échantillons avec STV-Cy3, conformément aux détails décrits dans le protocole écrit, conserver les échantillons à quatre degrés Celsius. Enfin, analyser les échantillons par cytométrie en flux.