JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 3:00 min • August 31st, 2026
Commencez avec une plaque multipuits contenant une suspension de phage diluée de façon sérielle dans un bouillon riche en nutriments en tant que traitement, et un bouillon sans phage en tant que témoin.
Ajouter E. coli dans chaque puits. À l'aide d'un spectrophotomètre, mesurer la densité optique de base (OD) afin d'enregistrer la concentration initiale de bactéries.
Ensuite, incuber la plaque pour permettre la croissance bactérienne et l'infection par le phage.
Dans le témoin, les bactéries utilisent les nutriments et prolifèrent, augmentant ainsi l'OD.
Dans le traitement, les phages se lient aux récepteurs de la surface bactérienne et injectent leur génome dans le cytoplasme.
En utilisant le mécanisme cellulaire de l'hôte, le génome viral se réplique et produit des protéines virales, qui s'assemblent en de nouvelles particules virales. Ces particules lysent la cellule, libérant ainsi la descendance virale.
Effectuez des mesures de DO à intervalles réguliers pour comparer la croissance bactérienne.
Les puits témoins montrent une augmentation progressive de la DO, tandis que les puits traités aux phages présentent des valeurs de DO plus faibles, avec des réductions plus importantes à des concentrations élevées de phages.
Ceci permet de déterminer la concentration de phage nécessaire pour une inhibition maximale de la croissance bactérienne.
Pour commencer, mettez en place le test en microplaque en utilisant des pointes filtrantes afin d'éviter toute contamination croisée. Ajoutez d'abord 180 microlitres de mTSB dans les puits des colonnes une à 12 de la microplaque 96 puits. Préparez ensuite des dilutions sérielles dix fois décroissantes de chaque phage dans les colonnes une à huit des microplaques stériles 96 puits pour installer le test. Ajoutez 20 microlitres de phages individuels ou de cocktails de phages dans les puits un à huit de la rangée supérieure A de la microplaque.
Pour les témoins sans phage et le témoin blanc, ajoutez 20 microlitres de mTSB dans la première rangée des colonnes 9 à 12. Pendant le pipetage, mélangez le contenu des puits par aspiration douce et répétée au moins cinq fois, en changeant systématiquement de pointe entre chaque dilution. Retirez 20 microlitres de la dernière rangée H, puis préparez un réservoir pour la souche bactérienne testée en transférant deux à trois millilitres de la culture diluée dans le réservoir à l’aide d’une pipette de un millilitre.
À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 20 microlitres de la culture bactérienne diluée dans chaque puits des colonnes une à dix, en changeant les embouts après chaque ajout. Couvrir et incuber la microplaque à 37 degrés Celsius. Toutes les deux heures, retirer la microplaque de l’incubateur et lire la plaque à l’aide d’un lecteur de microplaque.
Alternativement, incuber la plaque dans un lecteur de microplaques et effectuer des lectures au fil du temps.