Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 2:48 min • August 31st, 2026
Prenez une culture cellulaire de mammifères en phase stationnaire avec une réplication de l'ADN minimale et collectez le milieu conditionné.
Ajouter le virus de l'herpès simplex (HSV) et incuber avec agitation occasionnelle afin de permettre l'attachement viral. Laver pour éliminer le virus non lié et rétablir le milieu conditionné.
Après incubation, le virus fusionne avec la membrane de l'hôte, libérant le nucléocapside dans le cytoplasme.
L'ADN double brin viral pénètre dans le noyau, s'arrondit et exprime des protéines virales nécessaires à la réplication de l'ADN viral.
Les protéines virales et cellulaires déroulent l'ADN viral et synthétisent un brin d'ARN amorce. Ensuite, le complexe de polymérase ADN viral se fixe et allonge l'amorce pour la synthèse de l'ADN.
À mesure que la réplication progresse, ajouter un analogue de nucléoside au milieu de culture. Celui-ci pénètre dans les cellules et est converti en forme triphosphate.
Étant donné que la réplication de l'ADN de l'hôte est minimale, l'analogue est incorporé de préférence dans l'ADN viral en cours de réplication, marquant ainsi les génomes viraux.
Les génomes viraux marqués sont prêts pour une analyse protéomique en aval des protéines associées.
Commencez cette procédure par la culture des cellules MRC-5, comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, diluez l'HSV-1 dans du tampon salin au tris froid ou TBS. Pour les étapes suivantes, il est important d'éteindre le ventilateur et la hotte de culture cellulaire afin d'éviter que les cellules ne s'assèchent.
Utilisez une pipette pour transférer le milieu de croissance des cellules MRC-5 dans un flacon stérile afin de le réajouter aux cellules après l'infection. Infectez les cellules en ajoutant sept millilitres de virus dilué aux cellules. Agitez doucement les cellules toutes les 10 minutes pendant une heure à température ambiante.
Après l'adsorption, aspirez l'inoculum, rincez les cellules avec 50 millilitres de TBS à température ambiante et remplacez le milieu de croissance d'origine. Incubez ensuite les cellules à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone. Après le début de la réplication de l'ADN viral, environ quatre heures après l'infection, marquez l'ADN viral en cours de réplication.
Pour ce faire, diluez l'EdC dans un millilitre de milieu de croissance et ajoutez-le au milieu de culture des cellules infectées pendant deux à quatre heures.