Isolement de protéines à partir de complexes ADN viral-protéine

Prenez les noyaux cellulaires contenant les génomes viraux, marqués avec des nucléotides modifiés par un alcyne.

Suspendre les noyaux dans un mélange d'azoture de biotine et d'ions cuivre, puis incuber.

L'ion cuivre favorise la liaison covalente entre l'azoture et le groupe alcyne.

Centrifuger et jeter le surnageant.

Resuspendre dans le tampon, transférer et centrifuger pour former un culot.

Congelez rapidement, puis décongelez le culot pour faciliter la lyse.

Resuspendre et soniquer pour lyser les noyaux.

Centrifuger et recueillir le surnageant contenant les complexes protéine-ADN viral.

Filtrez le surnageant pour éliminer les contaminants.

Étendre le filtrat.

Ajouter des billes magnétiques revêtues de streptavidine et incuber pour favoriser la liaison avec les complexes protéine-ADN biotinylés.

Appliquez un champ magnétique pour récupérer les billes et lavez-les pour éliminer les contaminants.

Répétez le lavage.

Ajouter un tampon d'élution et chauffer pour séparer et dénaturer les protéines.

Séparez les billes, récupérez l'éluat.

Congelez rapidement les protéines isolées. Conservez-les à des températures ultra-basses pour des analyses ultérieures.

Après avoir complètement éliminé le PBS, re-suspendre le culot nucléaire dans 10 millilitres de mélange de réaction « click », en pipetant doucement cinq fois de haut en bas avec une pipette de 10 millilitres. Faire tourner l'échantillon pendant une heure à quatre degrés Celsius, puis centrifuger les noyaux comme précédemment.

Éliminer complètement le mélange de réaction click, puis laver le culot en le re-suspendant délicatement dans 10 millilitres de PBS et en centrifugeant à nouveau. Ensuite, re-suspendre soigneusement le culot nucléaire dans un millilitre de PBS et transférer la solution dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Après la centrifugation, éliminer complètement le PBS et congeler rapidement le culot dans de l'azote liquide.

À ce stade, le culot peut être conservé à -80 °C ou la procédure peut être poursuivie. Pour lyser les noyaux et fragmenter l'ADN, resuspendre les noyaux décongelés dans 500 µL de tampon B1 en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Incuber la suspension sur de la glace pendant 45 minutes.

Ensuite, soniquez les échantillons six fois pendant 30 secondes chacun à une amplitude de 40 %, en utilisant une sonde microtip de trois millimètres. Placez les échantillons sur de la glace pendant au moins 30 secondes entre chaque impulsion. Après la sonication, les échantillons doivent apparaître clairs, non troubles.

Éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 14 000 x g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. La taille du culot devrait diminuer considérablement. Filtrer le surnageant à travers un tamis cellulaire de 100 microns et conserver l'écoulement. Ensuite, ajouter 500 microlitres de tampon B2 au surnageant filtré.

Pour lier l'ADN biotinylé aux billes revêtues de streptavidine, préparez les billes magnétiques streptavidinées en transférant 300 microlitres de suspension de billes dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Préparez un tube de billes par échantillon. Lavez les billes trois fois avec un millilitre de tampon B2 en vortexant pour les resuspendre, en appliquant le tube sur un aimant pour séparer les billes, puis en aspirant le tampon de lavage.

Ensuite, ajoutez 900 microlitres de l'échantillon aux billes lavées. Le reste de l'échantillon sera utilisé pour l'isolement de l'ADN témoin et des protéines. Incubez la suspension en rotation toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, placer les échantillons dans un support magnétique pour microtubes et éliminer le surnageant. Resuspendre délicatement les billes dans un millilitre de tampon B2, puis incuber sous agitation à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Éliminer à nouveau le surnageant à l’aide du support magnétique pour microtubes.

Cette fois, re-suspendre délicatement les billes dans un millilitre de tampon B3 et incuber à quatre degrés Celsius sous agitation pendant cinq minutes. Après avoir éliminé le surnageant du mélange de billes à l’aide de l’aimant, re-suspendre les billes dans 50 microlitres de tampon d’échantillonnage 2x Laemmli afin d’éluer les complexes ADN-protéine. Ensuite, faire bouillir les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Vortexez un mélange avant de faire rapidement tourner les échantillons dans une microcentrifugeuse. Appliquez les échantillons sur l'aimant et transférez l'éluat dans un nouveau tube. Enfin, congélez rapidement les échantillons et stockez-les à 80 degrés Celsius.

Effectuer l'analyse des protéines comme décrit dans le protocole écrit.