Un dispositif recouvert de silicone imprimé en 3D pour modéliser une infection des voies urinaires associée à un cathéter

Prenez une plaque multi-puits contenant de l’urine humaine stérile.

Inoculez les puits d’essai avec des bactéries. Les puits témoins ne contiennent que de l’urine.

Prenons l’exemple d’un dispositif imprimé en 3D, recouvert de silicone, imitant la surface interne d’un cathéter, où des biofilms se développent lors d’infections urinaires associées au cathéter.

Placez-le dans les puits, fermez la plaque et incubez-le.

Les bactéries se fixent à la surface de l’appareil, utilisent les nutriments de l’urine et forment des biofilms.

Rincez l’appareil avec un tampon pour éliminer les bactéries légèrement liées.

Placez l’appareil dans une plaque multipuits contenant du violet cristallin, qui interagit avec le biofilm pour le colorer.

Rincez-le à l’eau et séchez-le.

Immergez l’appareil dans une plaque multipuits contenant une solution acide pour perturber les interactions colorant-biofilm et libérer le colorant dans la solution.

Mesurer l’absorbance des solutions dans chaque puits à l’aide d’un spectrophotomètre.

Une absorbance plus élevée dans les puits de test par rapport aux puits de contrôle confirme la formation de biofilm sur le dispositif, indiquant son aptitude à modéliser l’infection des voies urinaires associée au cathéter.

Pour commencer, prélevez un échantillon groupé d’urine humaine. Aliquote 135 microlitres d’urine humaine accumulée dans chaque puits d’essai d’une plaque de 96 puits en suivant la disposition désignée.

Inoculer chaque puits d’essai avec 15 microlitres de culture bactérienne normalisée pendant la nuit pour obtenir un volume final de 150 microlitres par puits. Réservez au moins 100 microlitres de cette culture pour les étapes ultérieures de validation de la dilution en série.

Préparez des puits de contrôle négatif en ajoutant 150 microlitres d’urine humaine stérile dans des puits désignés.

Maintenant, insérez les chevilles dans leurs puits correspondants. Appuyez sur le couvercle de la cheville jusqu’à ce qu’il affleure la plaque et fixez-le avec le couvercle de la microplaque, en le collant si nécessaire.

Placez ensuite les modèles à chevilles dans une cuve ou un sac en plastique scellé contenant un rouleau bleu humide pour éviter l’évaporation. Incuber statiquement pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.

Pour la validation de l’inoculum, aliquote 180 microlitres de PBS dans les rangées 2 à 6 de la première colonne d’une plaque de 96 puits avant d’ajouter la culture réservée.

Maintenant, transférez 20 microlitres du premier puits dans le deuxième puits, en mélangeant doucement en pipetant de haut en bas. Continuez les dilutions en série jusqu’à ce que l’inoculum initial ait été dilué dans le puits final.

Ensuite, plaquez 10 points de microlitres de chaque dilution sur un milieu solide approprié en trois exemplaires. Après une nuit d’incubation à 37 degrés Celsius, comptez les colonies de chaque endroit.

Pour la quantification du biofilm, retirez le modèle à chevilles de la microplaque et retournez-le sous une flamme ou à l’intérieur d’une enceinte de sécurité microbiologique, avec les chevilles vers le haut. Jetez les microplaques utilisées.

Transférez le couvercle de la cheville dans une microplaque fraîche contenant 180 microlitres d’aliquotes de PBS stérile pour rincer les cellules non collées.

Ensuite, en travaillant de manière aseptique, placez un support de tube à essai en verre stérile sur le banc et fixez le haut du rack ajusté qui maintient le couvercle de la cheville.

À l’aide d’une micropipette, aliquote 600 microlitres de PBS stérile dans chaque tube à essai. Maintenant, insérez le couvercle de la cheville dans le support, en vous assurant que les chevilles sont alignées avec les tubes à essai. Retirez tout ruban adhésif d’autoclave du couvercle.

À l’aide d’une pince stérile, enfoncez chaque cheville à travers le couvercle dans les tubes à essai situés directement en dessous. Ensuite, remplacez les capuchons des tubes à essai et faites tourbillonner chaque tube pendant 60 secondes pour déloger les cellules associées au biofilm.

Retirez 100 microlitres de chaque tube vortex et effectuez des dilutions en série dans du PBS stérile comme cela a été fait précédemment.

Pour colorer les cellules avec du violet cristallin, pipetez 180 microlitres de violet cristallin à 0,1 % en poids par volume dans de l’eau distillée stérile dans les 24 puits d’essai d’une plaque de 96 puits. Insérez le modèle de cheville rincée dans les puits correspondants et incubez à température ambiante pendant 20 minutes.

Après la coloration, retirez le modèle de cheville de la plaque et jetez la plaque usagée. Dans une baignoire propre, rincez tout le modèle à l’eau courante du robinet en agitant doucement.

Après 2 autres lavages, retournez le modèle à chevilles et laissez-le sécher complètement à température ambiante. Ajoutez ensuite 180 microlitres d’acide acétique à 30 % dans une nouvelle plaque à 96 puits. Insérez le modèle à cheville séchée dans les puits correspondants.

Lorsque l’incubation est terminée, retirez le modèle à cheville de la microplaque. Mesurez la densité optique des puits colorés à 540 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques ou d’un spectrophotomètre.